飞蝗Argonaute1的分子特性及生物学功能

摘要

[目的]MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的非编码RNA,通过转录后调控的方式在多种生命活动中发挥重要功能.Argonaute1 (AG01)蛋白作为miRNA沉默复合物(miRNA silencing complex RISC)的重要组成部分,在miRNA调控通路中起着关键作用.论文旨在研究AG01的生物学功能及其对飞蝗(Locusta moratoria)生长发育的影响,为探索昆虫miRNA的生物合成和农业害虫的有效控制提供理论依据.[方法]采用生物信息学方法在飞蝗转录组数据库中获得LmAG01 cDNA序列;使用在线蛋白翻译软件(ExPASy)对LmAG01进行蛋白翻译,利用SMART分析LmAG01蛋白的功能结构域;选取家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等模式昆虫的同源序列与LmAG01氨基酸序列进行聚类分析,采用Phyml软件构建昆虫AG0蛋白的系统发育树;为了进一步研究LmAG01在飞蝗生长发育过程中的作用,使用T7 RiboMAXTM ExpressRNAi System体外合成LmAG01的dsRNA,在飞蝗4龄第2天和5龄第2天若虫期连续两次注射dsRNA进行干扰,同时注射dsGFP作为对照.分别收集注射dsRNA后48 h和72 h的整虫样品提取RNA,反转录为cDNA.通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测LmAG01在不同时间点的干扰效率并观察虫体的发育表型.同时,为了检测LmAG01沉默是否会影响miRNA的生物合成,采用RT-qPCR对飞蝗体内5个高丰度miRNA表达进行定量分析.[结果]LmAG01蛋白含845个氨基酸,具有典型的AG0蛋白家族保守结构域,即位于213-348位点的PAZ结构域和502-804位点的PIWI结构域.聚类分析表明,LmAG01蛋白与其他昆虫的AG01蛋白聚为一类.通过AG01氨基酸序列同源比对结果显示LmAG01与模式昆虫果蝇、家蚕AG01的氨基酸序列一致度高达82.2％和86.9％.RNAi结果表明,虫体注射dsLmAG01 48 h和72 h后,与对照组相比,LmAG01表达量均显著降低,干扰效率分别为88.1％和93.0％;进一步观察试虫生长发育的表型特征,与对照组相比,飞蝗4龄期注射ds LmAG01后其生长发育并没有出现明显异常,待蜕皮发育至下一龄期(即5龄期)时,出现大量死亡,死亡率为89.3％;荧光定量PCR结果显示注射dsLmAG0148 h后,飞蝗体内miRNA-252和miRNA-8的表达显著下降,干扰72 h后miRNA-7、let 7、miRNA-252、miRNA-8的表达均显著下降.[结论]飞蝗AG01除参与RSIC的形成以外,还可能参与miRNA的剪切加工过程进而调控飞蝗的正常发育.