飞蝗GFAT和GNA的分子特性及生物学功能研究

摘要

几丁质是昆虫表皮及围食膜的重要成分，许多酶参与几丁质的合成。研究昆虫几丁质合成途径关键酶的生物学功能，对于解析昆虫几丁质合成机制具有重要意义。本文选择了飞蝗几丁质合成途径的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸转胺酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase，GFAT)和葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶（Glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase，GNA），对这两个酶的序列特征，表达特性和生物学功能等进行了研究。
　　我们从飞蝗EST数据库获得GFAT基因的部分cDNA片段，采用5'-RACE技术获得飞蝗GFAT的5'端序列，通过拼接得到了飞蝗GFAT的cDNA全长。该序列长3202bp，开放阅读框ORF为2292bp，编码764个氨基酸，相对分子量为85.6kD。序列分析表明飞蝗GFAT与其他已知昆虫的GFAT蛋白具有较高的序列一致性，但是飞蝗GFAT蛋白N-端多出74个氨基酸。GFAT的催化位点在真核生物与原核生物中都很保守。磷酸化位点预测表明飞蝗GFAT含有5个PKA磷酸化位点S271、S326、S380、S567和S581，可能与PKA及AMPK的磷酸化调节有关。基于已知物种GFAT全长氨基酸序列构建系统进化树，结果表明昆虫GFAT按物种亲缘关系依次聚类，哺乳动物GFAT1和GFAT2形成两个独立的分支。飞蝗GFAT的mRNA表达分析表明，GFAT在飞蝗表皮中表达量最高，其次是脂肪体和翅芽;飞蝗GFAT在5龄表皮的发育表达图谱表明，GFAT在5龄初期表达量最高，随后逐渐降低。5龄飞蝗GFAT的mRNA被干扰后，93％的若虫在蜕皮过程中出现蜕皮困难而死亡的表型。上述研究表明:飞蝗GFAT参与了飞蝗表皮几丁质的合成，并可能受磷酸化和UDP-N-乙酰葡萄糖胺的反馈抑制调节。
　　采用生物信息学方法，在飞蝗EST数据库中得到飞蝗GNA的cDNA序列，全长1230 bp，开放阅读框ORF为612 bp，编码204个氨基酸。飞蝗GNA与其他物种GNA的氨基酸序列一致性很高，结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致。基于pET-28a(+)质粒构建飞蝗GNA重组蛋白原核表达载体，在大肠杆菌E coli BL21(DE3)菌株中成功表达飞蝗GNA重组蛋白，经过Ni-NTA亲和柱纯化得到单一目的条带，飞蝗GNA重组蛋白的酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37-50℃，最适pH为8.0-9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值，当D-GlcN6P的浓度为200μM时，Acetyl-CoA的Km=133.60μM;当Acetyl-CoA的浓度为200μM时，D-GlcN6P的Km=42.43μM。飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明，GNA在刚蜕皮后的表达量最高，之后逐步降低;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示:GNA的表达能够被有效沉默，但蜕皮及发育未受影响。飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响，因此，推测可能存在N-乙酰葡萄糖胺激酶(Glc NAc kinase)能代替GNA生成N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(Glc NAc 6P)用于几丁质的合成，从而形成对GNA缺失补救途径。
　　本文针对飞蝗几丁质合成途径两个关键酶谷氨酰胺:果糖-6-磷酸转胺酶和葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶，开展基因的cDNA序列分析、表达特性及功能研究，探讨了两个基因在飞蝗发育过程中的作用，研究结果为飞蝗表皮几丁质合成机制的阐明及害虫有效控制提供了重要的基础数据。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 飞蝗概述及防治现状

1．2 昆虫的体壁结构

1．3 几丁质及几丁质合成通路

1．4 谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶研究进展

1．5 葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶研究进展

1．6 主要研究内容及意义

第二章 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因的分子特性及生物学功能研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因cDNA克隆

2．1．3 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因mRNA表达分析

2．1．4 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因的RNA干扰研究

2．2 结果

2．2．1 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因的序列分析

2．2．2 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因的mRNA表达特性

2．2．3 飞蝗谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶基因的RNA干扰结果

2．3 讨论

第三章 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因的分子特性及生物学功能研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因cDNA序列分析

3．1．3 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因的mRNA表达分析

3．1．4 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因的RNA干扰研究

3．2 结果

3．2．1 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因的序列分析

3．2．2 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因的mRNA表达特性

3．2．3 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因的RNA干扰结果

3．3 讨论

第四章 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶原核蛋白表达与酶活测定

4．1 材料与方法

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶重组蛋白的原核表达及纯化

4．1．3 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性测定

4．2 结果

4．2．1 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶重组蛋白的原核表达结果

4．2．2 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的酶活性分析

4．3 讨论

全文总结

参考文献

研究成果

致谢

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