siRNA作用后培养的人视网膜色素上皮细胞蛋白质谱分析

摘要

目的 通过抑制人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞缝隙连接蛋白43(connexin 43,cx43)基因的表达,寻找差异蛋白,初步探讨ex43基因对RPE细胞生命活动的意义.方法 提取细胞总蛋白并定量分析,第一向电泳是用DH 3～10线性IPG预制胶条进行等电聚焦,第二向电泳是用SDS-PAGE凝胶再分离蛋白.银染PAGE凝胶、干燥,Powerlook 2100XL扫描凝胶.利用Image Master 2D Elite4.01图像分析软件进行分析,蛋白斑点相对分子质量和等电点采用二维校正法确定.随机选取图像分析中siRNA转染组与RPE细胞对照组凝胶图中volume值相差≥2倍的7个蛋白质斑点进行胶内酶切,经胶上原位酶切和质谱分析得到肽质量指纹图谱,查寻蛋白质数据库并鉴定差异蛋白质,分析其生物学意义.结果 RPE细胞对照组3块凝胶共分离出蛋白质斑点861个,组间匹配率达到92%;siRNA转染组3块凝胶共分离出蛋白质斑点887个,组间匹配率达到93%.经过软件图像分析,发现volume值相差≥2倍的点共78个.其中上调的16个,下调的18个.有19个点在RPE细胞对照组存在而siRNA转染组不存在,25个在siRNA转染组存在而RPE细胞对照组不存在.随机选取7个点进行蛋白质谱分析:SP-H抗原、P27BBP、有丝分裂活性蛋白激酶、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶和热休克蛋白70表达上调,β-aetin表达下降,电压依赖阴离子通道蛋白在转染siRNA后出现表达.结论 通过蛋白质谱发现ex43基因沉默后引起多种蛋白的表达失调,ex43可能参与RPE细胞的多种生命活动.