ILK-siRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞HIF-1α、VEGF表达及细胞增殖影响的研究

摘要

目的：观察整合素连接激酶(integrim linked kinase,ILK)在糖尿病鼠视网膜中的动态表达及在视网膜新生血管发展过程中的意义;探讨缺氧培养条件下人视网膜色素上皮(Human Retinal Pigment Epithelium,hRPE)细胞ILK的表达,及其与缺氧诱导因子1α(hypoxia induciable factor,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothclial growth factor,VEGF)表达的相关性;探讨ILK基因特异性的 siRNA干扰对缺氧培养下的人视网膜色素上皮(hRPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及其对缺氧hRPE细胞增殖的抑制作用。
　　方法：1)STZ方法建立32只糖尿病(DM)模型鼠,按照喂养时间随机分为DM1m、DM2m、DM3m和DM6M组,8只正常SD大鼠为对照组。免疫组化方法检测糖尿病不同时期视网膜CD105的表达用来评价视网膜新生血管的密度;Western blot及RT-PCR方法检测各组视网膜ILK的蛋白及mRNA表达,并同对照组比较。2)人的RPE细胞培养,使用化学缺氧诱导剂COCL2(150umol/L)模拟缺氧环境进行细胞缺氧培养。免疫组化方法检测正常培养及缺氧培养6、12、24、48、72小时人的RPE细胞中ILK的表达。使用Western blot方法检测以上各缺氧组及对照组hRPE细胞ILK、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,RT-PCR方法检测以上各组hRPE细胞ILK、HIF-1α及VEGF的mRNA的表达,并以各组mRNA的表达水平进行相关性分析。3)设计合成三条双链ILK小分子干扰RNA(ILK-siRNA)和无关对照siRNA,阳离子脂质体转染ILK的干扰片段抑制缺氧培养24hhRPE细胞中ILK的表达, RT-PCR方法检测三条ILK干扰片段的转染抑制率,选择ILK-siRNA150nm/L浓度转染hRPE细胞后缺氧培养24h,Western blot和RT-PCR方法半定量检测ILK的表达及其对HIF-1α、VEGF表达的影响;MTT法检测不同浓度ILK-siRNA1转染hRPE后缺氧培养不同时间的细胞增殖情况。
　　结果：1)CD105在对照组和DM1m组视网膜组织中不表达,在DM2m组阳性表达出现,DM3m、DM6m组CD105的表达明显升高,较相邻组有显著差异(P<0.05,P<0.01)。ILK的蛋白及mRNA表达于正常和糖尿病大鼠视网膜中, ILK蛋白表达在DM2m组开始显著升高, ILKmRNA则于DM1m组即开始有显著的表达升高,较对照组有显著差异(P<0.01)。2) ILK在正常培养hRPE细胞中有基础表达,在缺氧培养hRPE细胞中随着缺氧时间的延长ILK阳性染色增强。ILK蛋白于缺氧6h开始明显表达升高,持续高表达至48h,缺氧6h、12h,24h,48h组ILK蛋白表达较对照组均有显著差异(P<0.01);HIF-1α蛋白在正常组中未测得表达,在缺氧12h组HIF-1α表达量达到高峰并持续高表达至48h组, VEGF在正常组呈现弱表达,随着缺氧时间的延长表达升高,24h达到最高峰,VEGF蛋白表达高峰较HIF的表达高峰延迟一个时间点。RT-PCR显示ILK、HIF-1α、VEGF在正常培养的hRPE细胞中均有一定的转录水平,随着缺氧时间延长三者表现了相同的上升趋势。相关分析ILK、HIF-1α,VEGF mRNA的表达呈正相关性(P<0.01)。3)Lipofectamine2000能够成功介导ILK-siRNA和无关siRNA转染hRPE细胞,转染率>75％,三条双链ILK-siRNA均可有效的抑制ILK的基因表达,抑制率为55.70%-65.82%,选择50nm/LILK-siRNA1干扰ILK在缺氧24hhRPE细胞中的表达,ILK蛋白表达较对照组降低了68.98%,HIF-1α,VEGF的蛋白表达较对照组分别降低了68.36%、50.60%。ILK的mRNA表达被显著抑制,同时显著抑制了HIF-1α,VEGF的mRNA表达,较无关转染组和对照组均有显著差异(P<0.01)。10nm/L ILK-siRNA1对缺氧hRPE细胞的增殖没有明显的影响,在浓度为20-50nm/L范围ILK-siRNA1呈时间、浓度依赖性抑制缺氧hRPE细胞的增殖。
　　结论：1)ILK在糖尿病视网膜中持续表达升高,与CD105的表达平行,可能参与了糖尿病视网膜新生血管的形成和发展。2)ILK在缺氧的hRPE细胞中表达升高,且与HIF-1α、VEGF的表达呈相同升高趋势。ILK可能与HIF-1α、VEGF共同参与人的视网膜色素上皮细胞的低氧病理过程。3)特异性的ILK-siRNA可以有效抑制缺氧hRPE细胞中ILK的表达,且抑制HIF-1α,VEGF的表达及hRPE细胞的缺氧增殖。结果提示ILK为HIF-1α、VEGF的上游调控因子,ILK的抑制可以从两个方面来调控缺血缺氧视网膜脉络膜新生血管的产生和发展。

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前言

第一部分 整合素连接激酶ILK在糖尿病大鼠视网膜中的表达及意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞整合素连接激酶ILK表达及其与HIF-1α、VEGF的表达的相关性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 ILK-siRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞HIF-1α、VEGF表达及细胞增殖影响的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

综述

附录

致谢