尼古丁受体CHRNA5亚基突变对其功能影响的初步研究

摘要

目的:研究CHRNA5亚基突变对尼古丁受体功能的影响.方法:通过RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,并通过重叠延伸PCR方法对CHRNA5亚基基因定点突变,从而构建CHRNA5突变型及野生型表达载体,然后转染至HEK293T细胞中,检测其基因表达.并将其分别与CHRNA3和CHRNB4共转至HEK293T细胞中,检测三质粒共转后的基因表达;通过采用尼古丁持续灌流细胞10 min,然后检测细胞内钙离子内流峰值的变化情况,接下来检测突变对转染后细胞活力的影响.结果:构建的CHRNA5表达载体在转染HEK293T细胞48h后,能够检测到绿色荧光蛋白的表达,这证明重组载体已成功转染进HEK293T细胞;通过RT-PCR检测出转染细胞CHRNA5 mRNA表达,这证明CHRNA5突变型和野生型均在HEK293T细胞中成功进行了表达.通过尼古丁灌流细胞实验显示突变组和野生型组F340/F380峰值变化均值分别为0.865± 0.048和0.447±0.127,突变体组峰值显著高于野生型组(P＜0.05).细胞活力检测实验发现0.01 mM和0.1mM尼古丁刺激下突变组的细胞活力峰值分别为139％和137％,显著高于野生组的124％和126％,有显著差异(P＜0.05).结论:本研究成功构建了CHRNA5突变及野生型真核表达载体,发现CHRNA5的突变会导致其受体功能性改变,并影响细胞活力.