缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

摘要

目的:探究缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其分子机制.方法:将编码过表达野生型SIRTl以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)突变型SIRT1 (SIRT1NLSmt)的慢病毒载体转染人类结肠癌HCT116细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达野生型SIRT1细胞株(LV-SIRT1细胞)和细胞质定位的NLS突变型SIRT1细胞株(LV-SIRT1NLSmt细胞),通过观察慢病毒载体编码的SIRT 1-GFP融合蛋白的荧光定位,明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位.利用real-time PCR、Western blot法对分离提取的核-质蛋白进行检测,证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况.利用CCK-8细胞毒性实验、流式细胞术检测和TUNEL染色比较缺氧(1％O2)处理前后LV-SIRT1和LV-SIRT 1NLSmt细胞存活或凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白p53、ac-p53 (K382)、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3表达水平.结果:Western blot、real-time PCR和免疫荧光染色结果显示稳定转染细胞均存在外源性SIRT1的过表达,NLS突变可导致SIRT1NLSmt富集于细胞质中;与亲本细胞HCT116和LV-SIRT1 NLSmt细胞相比,LV-SIRT1细胞对缺氧的耐受能力最差、细胞凋亡水平最高,凋亡相关蛋白p53、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3表达水平显著升高,ac-p53 (K382)和Bcl-2表达水平显著下降,且LV-SIRT1细胞的胞核ac-p53下降最为显著.结论:在缺氧微环境中,细胞核定位的SIRT1通过影响p53的去乙酰化水平促进结直肠癌细胞凋亡.