人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

摘要

目的 构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定.方法 根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入KpnⅠ、XmaⅠ和SalⅠ酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的pRSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析.结果 测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体pBSKS-MCS(简称pRSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体pRSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83％;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支.结论 测序及酶切分析结果表明已成功构建RSV LZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础.