新城疫病毒V4株全基因组测序及全长cDNA克隆的构建

摘要

反向遗传技术是近10年来迅速发展起来的一种病毒学研究方法，在研究病毒基因功能和研制新型疫苗方面有广阔的应用空间。新城疫病毒反向遗传系统的成功建立始于1999年，迄今为止已成功拯救的病毒株包括La Sota、Clone30、BC、ZJ1等，但V4株的反向遗传拯救系统尚未见报道。新城疫V4株是1966年澳大利亚学者Simmons分离到的自然弱毒，该毒株是自然无毒株，主要介导细胞免疫，最大优势在于其独特的耐热性，更适合在发展中国家推广使用。
　　 本实验首先对实验室保存的V4株进行了三轮的蚀斑纯化，由于V4株属无毒株，其在CEF细胞中很难形成可见的蚀斑，因此我们采用了用胰酶处理V4病毒，并在上层胶中添加尿囊液及Mg2+，这样可以偶尔产生可见的蚀斑，但实验结果重复性很差。得到的各蚀斑克隆株经56℃水浴耐热实验及-20℃反复冻融实验，比较它们的血凝性变化趋势，选择耐热及耐冻融性状更好的克隆株；实验表明，各克隆株之间耐热性存在明显差异，说明保存的V4毒是由不同的克隆株混合在一起的混合体，选择耐热能力最强的11号毒株进行后续实验。同时，对各克隆株F基因内部47-435bp的片段进行扩增、测序，比较序列后表明完全相同，说明保存的V4毒并不存在杂毒污染。
　　 设计了13对引物对全基因进行了扩增及测序，并最终获得了V4株全基因序列。序列分析表明V4株基因组全长15186nt，3’端和5’分别存在55nt的leader区和114nt的trailer区，中间部分包括NP、P、M、F、HN及L基因，各基因又由两端的非编码区和中间部分的开放性阅读框（open reading frame，ORF）组成。对各结构蛋白的基因进行了同源性分析及进化树分析，在参比的各毒株中NDV V4株NP、P、F和HN基因都是与Qv4株的同源性为最高，分别为99.9％、96.7％、100％、99.8％，M基因与HB92株同源性最高，为99.4％，与QV4株为96.8％；L基因与已知的毒株比较，与HB92同源性最高，为99.4％。
　　 设计10对引物分别扩增各个cDNA片段，并最终连接为全长cDNA质粒pFT7-final，使得cDNA片段连接于T7启动子之后：同时构建了polⅡ启动子及NDV特异性核酶控制下的全长cDNA克隆pFpolⅡ-V4-final。在基因组3166bp处设计引物，利用融合PER技术插入PmeI酶切位点，并在该位点插入了传染性法氏囊病病毒（IBDV）的主要抗原蛋白VP2的开放阅读框，构建了T7启动子控制下的拟表达VP2抗原的V4株全长cDNA克隆pBRT7-VP2。设计引物扩增了V4株3’leader区及5’trailer区，经融合PCR进行融合后与原始载体pPolⅡ-BDV通过NgoMIV、SfiI酶切位点连接为pBR-LT；扩增了绿色荧光蛋白（EGFP）的开放阅读框并利用两末端的ClaI、SphI酶切位点，将其反向插入到pBR-LT中，构建了V4株微基因组pBR-EGFP。pBR-EGFP与辅助蛋白pCIneo-NP、pCIneo-P、pCIneo-NP以及负责产生T7聚合酶的质粒pCAGGS-T7共转染BHK21细胞，可见很强的绿色荧光表达，说明辅助质粒及pCAGGS-T7均可正常工作；通过与pEGFP-N1对照做了对比实验，多质粒共转染的效率约10％左右；而在pEGFP-N1单质粒转染组，转染效率可达到约40-50％，说明共转染的效率较低；中发挥了一定作用。
　　 虽然最终经过多次重复拯救实验，我们没能获得V4株的救获病毒，但目前已完成的工作已为V4株反向遗传体系的建立打下了坚实基础，在拯救体系及条件上进行改进后，有望于近期拯救成功。
　　 本实验首先通过蚀斑纯化的方法对保存的V4毒株进行了三轮纯化，比较了不同克隆株问耐热性及耐冻融性的差异，选择了综合性状更优良的克隆株；完成了该克隆株的全基因组序列的测定，分析了主要结构蛋白NP、P、M、F、HN和L的基因序列，比较了与其他毒株的核苷酸、氨基酸同源性及进化树分类结果，表明保存的V4株是QV4株的传代毒。构建了三个全长cDNA克隆，分别为T7启动子控制下的pFT7-final，Ⅱ型启动子控制下的pFpolⅡ-V4-final，以及在pFT7-final中插入了IBDV的VP2基因的嵌合cDNA克隆pBRT7-VP2；构建了V4株微基因组pBR-EGFP，共转染实验表明拯救体系及辅助质粒均正常工作；辅助病毒包装实验表明V4株3’leader区及5’trailer区在病毒的包装过程中发挥了一定作用。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1.引言

1.1 反向操作概况

1.1.1 反向遗传技术原理

1.1.2 反向遗传技术研究进展

1.1.3 反向遗传常见表达系统

1.2 新城疫概况

1.2.1 新城疫病毒分子生物学

1.2.2 新城疫反向遗传技术进展

1.2.3 新城疫V4疫苗株概况

1.3 传染性法氏囊病毒VP2研究进展

1.4 本课题拟解决的问题

2.材料与方法

2.1 病毒纯化

2.1.1 病毒活化

2.1.2 蚀斑纯化

2.1.3 耐热实验及冻融实验

2.1.4 PCR测序

2.1.5 鸡胚半数感染量（EID50）的测定及MDT测定

2.2 V4株全长基因组测序及序列分析

2.2.1 菌种与质粒

2.2.2 主要上具酶及试剂

2.2.3 主要仪器

2.2.4 方法

2.3 全长基因组cDNA克隆的构建

2.4 全长cDNA克隆序列修改

2.4.1 基因组6912nt处缺失碱基的回复突变

2.4.2 pF3T1与pV4A质粒的连接

2.4.3 pF3T1+与原全长cDNA质粒pBRT7-V4的替换

2.4.4 11764nt处缺失碱基的回复突变

2.4.5 合成序列与pBRT7-V4Φ的替换连接

2.4.6 Ⅱ型启动子全长cDNA克隆的构建

2.5 全长cDNA中PmeI酶切位点的引入及IBDV VP2基因插入

2.6 微型基因组的构建

2.6.1 PCR扩增及质粒构建

2.6.2 微基因组表达验证实验及转染效率比较

2.6.3 辅助病毒包装实验

2.6.4 BSR细胞功能鉴定

2.7 病毒的拯救

3 结果

3.1 病毒纯化

3.1.1 蚀斑纯化实验

3.1.2 耐热实验及抗冻融实验

3.1.3 针对F基因编码区47-435bp的特异扩增

3.1.4 鸡胚半数感染量（EID50）及平均致死时间（MDT）的测定

3.2 V4株全长基因组序列测定及序列分析

3.2.1 PCR结果及重组质粒鉴定结果

3.2.2 序列比较分析

3.2.3 耐热性相关基因分析

3.3 全长cDNA克隆的构建

3.3.1 各片段cDNA合成PCR结果

3.3.2 中间部分cDNA片段的连接

3.3.3 两末端cDNA片段的连接

3.3.4 全长cDNA质粒pBRT7-V4和pBRPolⅡ-V4的构建

3.4 全长cDNA克隆序列修正

3.4.1 基因组6912nt处缺失碱基的回复突变

3.4.2 pF3T1与V4A质粒的连接

3.4.3 质粒pF3T1+与pBRT7-V4的替换

3.4.4 11764nt处缺失碱基的回复突变

3.4.5 合成序列与pBRT7-V4Φ的替换连接

3.4.6 Ⅱ型启动子全长cDNA克隆的构建

3.5 全长cDNA中PmeI酶切位点的引入及IBDV VP2基因插入

3.6 微型基因组的构建

3.6.1 Leader、Trailer区的扩增及连接

3.6.2 EGFP扩增及微型基因组构建

3.6.3 融合PCR产物与低拷贝载体pBR322的连接

3.6.4 微基因组表达验证实验及转染效率比较

3.6.5 微基因组包装实验

3.6.6 BSR细胞功能鉴定

3.7 病毒的拯救

4 讨论

4.1 病毒的纯化

4.2 全长cDNA克隆的获得

4.3 NDV做为疫苗载体的可行性

4.4 微基因组表达成功及病毒拯救失败带来的启示

4.5 Ⅱ型启动子在NDV拯救中的应用

5 结论

致谢

参考文献

附表

攻读学位期间发表的学术论文