清开灵注射液体外抗2型登革病毒的作用

摘要

目的 研究清开灵注射液(简称清开灵)体外抗2型登革病毒(dengue virus 2,DENV2)的作用.方法 ①稀释清开灵至不同质量浓度(72.000、63.000、54.000、45.000、22.500、11.250 mg/mL),同时稀释利巴韦林注射液(简称利巴韦林,12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391 mg/mL)作为阳性对照,生理盐水为空白对照,利用MTT比色法分别检测上述药物对人肝癌细胞HepG2株的细胞毒性作用,并确定各药物的最大无毒质量浓度;②分别稀释清开灵和利巴韦林并与DENV2(MOI =0.5)等体积混合孵育30 min后,接种于HepG2细胞,于2、8、24 h后取细胞上清,利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测阳性细胞率和实时定量聚合酶链反应(realtime quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测DENV2基因组表达水平,验证清开灵对DENV2的直接灭活作用;③稀释清开灵或利巴韦林并与DENV2(MOI =0.5)等体积混合后接种于HepG2细胞,2h后收获细胞,利用IFA验证清开灵对DENV2的抑制作用;④DENV2(MOI=0.5)感染HepG2细胞1h后,弃上清加入含清开灵或利巴韦林的维持液,于感染后2、8、24 h收获细胞上清,利用IFA和qPCR验证清开灵直接给药的抗病毒作用;⑤用清开灵或利巴韦林预处理HepG2细胞2h,加入DENV2(MOI=0.5)孵育1h弃上清,再次相应加入清开灵和利巴韦林(维持治疗),于感染后2、8、24 h收获细胞上清,IFA和qPCR验证清开灵预给药联合维持治疗的抗病毒作用.结果 ①清开灵的最大无毒质量浓度为11.250 mg/mL,利巴韦林的最大无毒质量浓度为1.563 mg/mL;②直接灭活:2、8、24 h,清开灵和利巴韦林检测水平均优于空白对照(P＜0.01),而且清开灵在2h和24h的IFA检测水平均优于利巴韦林(P＜0.01),以及8h和24 h的qPCR检测水平均优于利巴韦林(P＜0.01);③抑制病毒进入:清开灵与利巴韦林的IFA检测均优于空白对照(P＜0.01);④直接给药:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P＜0.01);⑤预给药联合维持治疗:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P＜0.01),而且清开灵的不同时相点的IFA检测水平均优于利巴韦林(P＜0.01).结论清开灵具有明显的体外抗DENV2的作用,且以预给药联合维持治疗的给药方式抗病毒作用最佳.