以双氯酚酸为探针采用高效液相色谱法快速测定CYP450 2C9的酶活性

摘要

目的 建立一种快速、高效的以双氯酚酸作为探针药物评价细胞色素P450 2C9(CYP2C9)酶活性的高效液相色谱.紫外检测方法.方法 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 柱(50mm×4.6mm 1.D.,5μm);流动相为乙腈(含0.01%七氟丁酸)-水(含0.01%七氟丁酸)(65:35,V/V),流速2.0mL/min;检测波长为280nm.双氯酚酸与人CYP2C9酶在37℃温孵适当时间后,加入100μL乙腈-冰乙酸(94:6,V/V)终止反应,10 000g离心后取上清液进样分析测定.结果 4'-羟基双氯酚酸的保留时间为1.35min,线性范围为1.00～200μmol·L-1(r:0.999 9),最低定量限为1.00 μmol·L-1,回收率为99.5%～100.8%;双氯酚酸的保留时间为2.25min,线性范围为1.00-200μmol·L-1(r=0.999 9),最低定量限为1.00μmol·L-1,回收率为99.3%-101.1%.两者的日内、日间RSD均<15%,温孵体系中的其他内源性物质不干扰测定.结论 该方法快速、稳定、灵敏度高,适合体外双氯酚酸及其代谢物4'-羟基双氯酚酸的测定,可应用于体外CYP2C9酶活性的评价及酶动力学的研究.