大菱鲆(Scophthalmus maximus)蛋白质二硫键异构酶SmPDIA3的表达分析和功能验证

摘要

本研究利用SMART-RACE技术克隆了大菱鲆SmPDIA3基因.SmPDIA3基因cDNA序列全长2083bp,包括1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,GenBank登录号:MG765516.组织表达分析发现:SmPDIA3基因在肠、鳃、肝脏等组织中均有表达,其中在肝脏中表达量最高,脑中最低.进一步研究了温度胁迫后SmPDIA3基因在肠和肝脏组织中的表达变化规律,发现随着胁迫温度的升高,SmPDIA3基因的相对表达量总体上升,并在28℃时达到最大.利用原核表达技术,构建了pET-28a-PDIA3原核表达载体,IPTG诱导后融合蛋白主要在上清中表达.将上清中的蛋白分离纯化后,利用Western blot技术验证了目的蛋白的准确性.将纯化后的目的蛋白浓缩后,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白浓度为243.18μg/mL.最后设计变性溶菌酶的复性实验,验证了SmPDIA3蛋白具有分子伴侣功能,能够辅助变性蛋白的正确折叠.