KANSL1蛋白的真核表达纯化及功能验证

摘要

目的 利用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)表达KANSL1蛋白并进行纯化,同时验证该蛋白在体外对微管蛋白聚合的影响.方法 构建真核表达载体pFast-Bac-HTB-mCherry-KA NSL1,转化大肠杆菌DH 10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒(Bacmid),用脂质体转染介导Bacmid进入草地贪夜蛾细胞(Sf9 cell),以产生可表达目的基因的重组杆状病毒.随后用此重组杆状病毒感染并扩增Sf9细胞使其大量表达His-mCherry-KANSL1融合蛋白.通过镍柱亲和层析对表达的His-mCherry-KANSL1融合蛋白进行初步纯化,再经快速蛋白液相色谱(FPLC)进一步纯化,利用Western印迹、考马斯亮蓝染色鉴定目的蛋白的表达纯化效果,最后通过体外微管聚合实验分析纯化的KANSL1蛋白对微管蛋白聚合的影响.结果 质粒测序显示,pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒构建成功;考马斯亮蓝染色、Western印迹表明纯化得到正确的His-mCherry-KANSL1蛋白,体外微管聚合实验显示KANSL1蛋白显著促进微管蛋白的聚合.结论 成功构建pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒并在真核表达系统中表达和纯化,重组KANSL1蛋白具有促进微管聚合的作用,为后续KANSL1蛋白功能研究奠定了基础.