Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用

摘要

目的：通过巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris）表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H（ endo-beta-N-acetyl-glucosaminidase H ，Endo-H），并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌（ Strepto-myces plicatus） Endo-H的cDNA序列，设计并合成Endo-H全基因，将其克隆至P．pastoris表达载体pPIC9中，重组质粒转化P．pastoris JC308宿主菌，工程菌经甲醇诱导，分泌表达Endo-H，目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后，纯度可＞95％。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳（ DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohy-drate electrophoresis，DSA-FACE）分析核糖核酸酶B（ribonuclease B，RNaseB）的糖基结构，比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F（peptide-N-asparigine amidase F，PNGase F）的糖基切割功能。结果利用P．pastoris表达制备Endo-H，可切割天然或变性状态下的β-1，4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链，不能切割复杂型糖链糖蛋白；经DSA-FACE分析，结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5 GlcNAc-Man9 GlcNAc，PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5 GlcNAc2-Man9 GlcNAc2，两者相差一个GlcNAc。结论通过P．pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性，可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。