过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母构建

摘要

目的通过过表达N-糖基转移酶,构建1株糖基化修饰效率更高的糖基工程酵母。方法利用尿嘧啶（URA3）营养缺陷型筛选标记,在糖基工程酵母4-32中转入醇氧化酶1（alcohol oxidase 1,AOX1）启动子控制的利士曼原虫N-糖基转移酶星状孢子素和温度敏感性酶3（staurosporine and temperature sensitivity 3,STT3）D亚基,通过SDS-PAGE、Western印迹和肽N-糖苷酶F（peptide-N-asparigineamidase F,PNGase F）酶切等方法,分析4-32-STT3D表达的抗人表皮生长因子受体2（HER2）抗体（anti-human epidermal growth factor receptor 2）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）N-糖基化程度,并测定STT3D转入和诱导表达对酵母生长情况的影响。结果 SDS-PAGE结果显示,4-32-HL菌表达的抗HER2抗体除有一条相对分子质量约55×103的重链主带外,还有一条约50×103的未糖基化条带。4-32-HL-STT3D菌表达为均一的55×103条带,无50×103条带。PNGase F酶切后,上述重链呈50×103的均一条带。Western印迹证明以上所有条带均为抗体成分。以GM-CSF作为报告蛋白验证STT3D的作用,结果显示,4-32-GM-CSF菌表达的GM-CSF为22×103和20×103的两条带,而4-32-GM-CSF-STT3D表达则为均一的22×103条带。PNGase F酶切4-32-GM-CSF和4-32-GM-CSF-STT3D菌表达的GM-CSF后,GM-CSF呈18×103的均一条带。分别测定STT3D外源基因转入和诱导表达时对酵母生长情况的影响,统计学分析显示,STT3D转入不诱导对酵母生长影响不显著,STT3D诱导表达对酵母生长影响极显著。结论过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母对靶标蛋白具有更高的N-糖基化修饰效率。