鼠李糖基转移酶原核基因工程菌的构建与表达条件优化

摘要

新橙皮苷在植物内的含量较低，其同分异构体橙皮苷在植物体内含量较高。两者的结构上的差异仅仅是黄酮环上取代基上葡萄糖与鼠李糖的糖苷键不同。本研究希望利用生物转化法将橙皮苷转化为新橙皮苷。本文通过构建一株原核工程菌来表达鼠李糖基转移酶，该酶可以催化鼠李糖与葡萄糖通过1,2糖苷键连接，以此来合成新橙皮苷，并且对其酶学性质进行研究，还对工程菌的产酶发酵条件进行了优化研究。主要的研究内容及结果如下：
　　1.原核工程菌的构建及表达：从Lactobacillus plantarum WCFS1的基因组中扩增得到编码鼠李糖基转移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family2(GT2)基因，将该目的基因与表达载体pET-DsbA连接，得到重组表达载体pET-DsbA-GT2。将表达载体导入表达菌株BL21(DE3)，成功构建得到了原核表达工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)；采用诱导剂IPTG对工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)进行诱导表达，GT2与DsbA成功的融合表达，得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白（其中，GT2的大小为35.7 kDa，DsbA的大小为21 kDa）。表达方式为部分包涵体、部分可溶性表达。
　　2.鼠李糖基转移酶的分离纯化及其酶学性质的研究：通过分离纯化分别得到了包涵体蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶（GT2-2）两种鼠李糖基转移酶。酶活测定结果显示GT2-1的比活力为0.41 U/mg，远低于可溶性目的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶学性质的研究结果：GT2-1、GT2-2两种酶的最适反应温度38-40℃，最适pH值为6.0-6.5；GT2-1、GT2-2在20-40℃处理1 h后的酶活仍能达到90％以上，当温度超过40℃时，GT2-1的酶活随着温度的升高迅速降低，当温度达到70℃时便完全失去酶活，GT2-2温度达到80℃才完全失去酶活；GT2-1、GT2-2在pH值在5-10这个范围内均具有较好的稳定性。
　　3.重组菌BL21(pET-DsbA-GT2)表达条件的优化：以表达系数F和表达量Q为表征量，对BL21(pET-DsbA-GT2)重组菌的表达条件进行了优化。最后得到的最优表达条件为：诱导时机选择为培养10-12 h后进行诱导；诱导时间为5-6 h；诱导温度为30℃；诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL；摇床转速为160 rpm。