酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

摘要

[背景]Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA (single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段.由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具.[目的]为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据.[方法]利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究.[结果]经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L.纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40％.Cas9核酸酶在25-42℃保温2h后剩余酶活保持在65％以上,而在45℃保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68％,在pH 9.0时稳定性最高;0.5-20.0 mmol/L浓度范围内的Mg2+对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg2+可使该酶酶活力提高约23％;Ba2+、Co2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu2+和Fe2+对Cas9核酸酶有完全抑制作用.[结论]异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义.