里氏木霉分泌型表达载体的构建及绿色荧光蛋白的表达

摘要

[目的]构建里氏木霉分泌型表达载体,通过表达绿色荧光蛋白论证载体的可行性并初步观察绿色荧光蛋白在里氏木霉中的分泌过程.[方法]应用PCR及分子克隆技术将里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶(CBHl)的启动子及CBH1自身信号肽、终止子和潮霉素筛选基因依次插入骨架质粒pUC19中,构建出rreesei表达载体Ppth 15.将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因装载入Ppth 15中,获得eGFP表达载体Ppth 15-eGFP.再将Ppth 15-eGFP转化进r reesei原生质体,通过潮霉素抗性筛选、基因组PCR检测等方法鉴定,获得阳性重组转化子.[结果]用PDA培养基培养阳性转化子2-3 d后,可在菌丝顶端、隔膜及培养基中清晰地观察到大量绿色荧光.[结论]表达载体构建成功且能够用于eGFP的表达,实验为进一步研究r reesei表达其他基因提供了有效工具,同时为r reesei胞外蛋白分泌的研究提供了参考.