融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用。该载体是一种环状载体，包含原核复制起点、真核复制起点、筛选标记基因和绿色荧光蛋白基因表达盒；所述绿色荧光蛋白基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段、绿色荧光蛋白编码区基因和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述绿色荧光蛋白编码区基因缺失起始密码子，所述连接片段含有EcoRV识别序列，所述绿色荧光蛋白编码区基因自5’末端第1位和第2位与EcoRV识别序列自5’末端的最后两位重叠；所述连接片段含有或不含有起始密码子；当所述连接片段含有起始密码子时，所述起始密码子与所述EcoRV识别序列自5’末端第一位间隔2+3n或1+3n位，n为正整数。该载体含有绿色荧光蛋白基因，且只有在插入的外源基因正确表达的情况下才能表达，从而可以有效的排除出发载体表达荧光而出现的干扰问题。

说明书

技术领域

本发明涉及融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

哺乳动物细胞真核表达载体是最常见的表达载体之一，被广泛的应用于科研，生产等领域。绿色荧光蛋白(EGFP)也越来越多的被作为基因表达的标记物用于科研的各个领域，其产物EGFP对细胞无毒性，且检测简单，不用任何底物或者其他辅助物既可以在荧光显微镜下直接观察到荧光，极大地方便了基因表达水平的检测与定位等。目前，在科研中真核蛋白绿色荧光蛋白共表达质粒用途广泛，如研究蛋白表达水平、对真核蛋白在哺乳细胞中的定位等。但是目前市场上使用的真核表达蛋白质粒构建表达外源基因质粒的过程中，是通过传统的连接方法连接的，首先要选择合适的酶切位点，要求连接的外源基因片段中没有所选择的酶切位点，然后用限制性内切酶酶切载体与外源基因片段，再用T₄DNA连接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤比较烦琐，成本高(需要购买内切酶与连接酶)，连接效率较低等问题，在构建过程中PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步的连接。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用。

本发明所提供的融合表达绿色荧光蛋白的表达载体，命名为pGBD-EGFP-Vector，是一种环状载体，包含原核复制起点、真核复制起点、筛选标记基因和绿色荧光蛋白基因表达盒；所述绿色荧光蛋白基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段、绿色荧光蛋白编码区基因和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述绿色荧光蛋白编码区基因缺失起始密码子，所述连接片段含有EcoRV识别序列，所述绿色荧光蛋白编码区基因自5’末端第1和第2位与EcoR

V识别序列自5’末端的最后两位重叠；所述连接片段含有或不含有起始密码子；当所述连接片段含有起始密码子时，所述起始密码子与所述EcoRV识别序列自5’末端第一位间隔2+3n或1+3n位，n为正整数。

其中，所述EcoRV识别序列为序列表中序列15’末端第713-718位，所述绿色荧光蛋白编码区基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第717-1436位。

当所述连接片段不含有起始密码子，所述绿色荧光蛋白编码区基因也缺失起始密码子，载体中的绿色荧光蛋白不表达，pGBD-EGFP-Vector载体在细胞中不会产生荧光，有利于区别空载体与插入外源基因的载体。

当所述连接片段含有起始密码子，所述绿色荧光蛋白编码区基因缺失起始密码子，为了使pGBD-EGFP-Vector载体在宿主菌中不会产生荧光，所述起始密码子与所述EcoRV识别序列(GATATC)自5’末端第一位的“G”间隔2+3n或1+3n位，n为正整数；这样可以保证所述起始密码子的ORF框与绿色荧光蛋白编码区基因的ORF框不一致，绿色荧光蛋白编码区基因不表达，pGBD-EGFP-Vector载体在细胞中不会产生荧光，可区别空载体与插入外源基因的载体。

当外源目的基因通过EcoRV识别序列(GATATC)同源重组到pGBD-EGFP-Vector载体中时，外源目的基因带有起始密码子，但不含有终止子，并且外源目的基因的起始密码子与所述EcoRV识别序列(GATATC)自5’末端第一位的“G”间隔3n位，n为正整数，外源目的基因的ORF框与绿色荧光蛋白编码区基因的ORF框一致，从而达到目的基因与荧光蛋白共表达的目的，可以在细胞中检测到荧光。

所述连接片段的核苷酸序列具体可为序列表中序列1自5’末端649-718位。

所述两个转录方向相同的启动子可为多种启动子，具体可为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子。所述真核复制起点可为任何现已知的真核生物进行DNA复制的起始点，具体可为SV40病毒复制起点。所述多聚腺苷酸加尾信号可为具有终止转录作用的所有DNA片段，具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原核复制起始位点可为任何现已知的原核生物进行DNA复制的起始点，具体可为大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点。

pGBD-EGFP-Vector载体的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。

用EcoRV酶切所述的融合表达绿色荧光蛋白的表达载体得到的线性载体也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供所述融合表达绿色荧光蛋白的表达载体的构建方法。

本发明所提供的融合表达绿色荧光蛋白的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体pGBD；

4)以重组载体pGBD为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：

5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体pGBD-SV40；

7)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC；3’和5’CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC3’进行PCR扩增，得到片段E；

8)以重组载体pGBD-SV40为模板，用如下引物：5’GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG3’和5’GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG3’进行PCR扩增，得到片段F；

9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，获得载体pGBD-SV40-EGFP-Vector；

10)以载体pGBD-SV40-EGFP-Vector为模板，用如下引物：5’GGAATTCTGCAGATATCGTGAGCAAGGGCG3’和5’CGCCCTTGCTCACGATATCTGCAGAATTCC3’进行PCR扩增，得到片段G，将片段G导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组得到所述融合表达绿色荧光蛋白的表达载体。

本发明的pGBD-EGFP-Vector含有绿色荧光蛋白基因，该基因只有在插入的外源基因正确表达的情况下才能表达，从而可以有效的排除出发载体表达荧光而出现的干扰问题。并且pGBD-EGFP-Vector含有一个真核复制起点，可以在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平。以本发明的pGBD-EGFP-Vector为出发载体，利用同源重组构建表达外源基因的重组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个构建过程中不使用任何内切酶与连接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。使用本发明的pGBD-EGFP-Vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。

附图说明

图1为pGBD-EGFP-Vector的结构示意图。

图2为荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达结果。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、pGBD-EGFP-Vector的构建

1)pGBD的构建

设计引物pGBD Vector1上游和pGBD Vector1下游、pGBD Vector2上游和pGBDVector2下游，引物pGBD Vector1上游和pGBD Vector1下游、pGBD Vector2上游和pGBD Vector2下游的核苷酸序列如下：

pGBD Vector 1上游：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3’；

pGBD Vector 1下游：5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’。

pGBD Vector 2上游：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC 3’(划线部分为

EcoR V酶识别位点)；

pGBD Vector 2下游：5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’。

以pEGFP-N1(Invitrogen)质粒为模板，用引物pGBD Vector1上游和pGBDVector1下游PCR扩增片段A，以pCDNA3.0质粒为模板，用引物pGBD Vector2上游和pGBD Vector2下游PCR扩增片段B。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pGBD。

2)pGBD-EGFP-Vector的构建

设计引物SV(40)上游和SV(40)下游、pGBD Vector(1)上游和pGBD Vector(1)下游，序列如下：

SV(40)上游：5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’；

SV(40)下游：5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’。

pGBD Vector(1)上游：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’；

pGBD Vector(1)下游：5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’。

以pEGFP-N1为模板，用引物SV(40)上游和SV(40)下游PCR扩增片段C；以pGBD为模板，用引物pGBD Vector(1)上游和pGBD Vector(1)下游PCR扩增片段D。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pGBD-SV40。

3)pGBD-SV40-EGFP-Vector的构建

设计引物EGFP上游和EGFP下游、pGBD-SV40 Vector(2)上游和pGBD-SV40Vector(2)下游，引物序列如下：

EGFP上游：5’CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC 3’；

EGFP下游：5’CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’。

pGBD-SV40 Vector(2)上游：5’GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 3’；

pGBD-SV40 Vector(2)下游：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG 3’。

以pEGFP-N1质粒为模板，用引物EGFP上游和EGFP下游PCR扩增片段E；以pGBD-SV40为模板，用引物pGBD-SV40 Vector(2)上游和pGBD-SV40 Vector(2)下游PCR扩增片段F。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段E和F后混匀，片段E和F质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该载体命名为pGBD-SV40-EGFP-Vector。

4)pGBD-EGFP-Vector的构建

设计引物pGBD-EGFP-Vector上游和pGBD-EGFP-Vector下游，pGBD-EGFP-Vector上游和pGBD-EGFP-Vector下游引物的核苷酸序列如下：

pGBD-EGFP-Vector上游：5’GGAATTCTGCAGATATCGTGAGCAAGGGCG 3’；

pGBD-EGFP-Vector下游：5’CGCCCTTGCTCACGATATCTGCAGAATTCC 3’。

以pGBD-SV40-EGFP-Vector为模板扩增片段G。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段G后混匀。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该载体命名为pGBD-EGFP-Vector。pGBD-EGFP-Vector图谱如图1所示。

将pGBD-EGFP-Vector测序，测序结果表明，pGBD-EGFP-Vector的核苷酸序列如序列表中的序列1，序列1自5′末端第1-629位为CMV启动子，自5′末端第630-648位为T7启动子，自5′末端第713-718位为EcoR V酶的识别序列，自5′末端第717-1436为绿色荧光蛋白基因，自5′末端1437-1791位为BGH Ploy A，自5′末端第1792-1993位为SV40 Origin，自5′末端第1994-2563位为COIE1 Origin，自5′末端第2564-3745位为氨苄青霉素抗性基因。

序列1的自5′端第700-715位的核苷酸序列和序列1的自5′端第716-730位的核苷酸序列为能与外源基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组的序列。

实施例2、pGBD-EGFP-Vector表达蛋白的能力

1)表达H5N1的M蛋白和绿色荧光蛋白的pGBD-M-EGFP-Vector的构建

设计引物M上游和M下游，引物序列如下：

M上游：5’GGAATTCTGCAGATCGCCACCATGAGTCTTCTAACCG 3’；

M下游：5’GCCCTTGCTCACGATCTTGAATCGTTGCATCTG 3’。

引物中GGAATTCTGCAGAT和GCCCTTGCTCACGA序列为能与序列1的自5′端第700-715位的核苷酸序列和序列1的自5′端第716-730位的核苷酸序列发生同源重组的序列。

以H3亚型流感病毒(Genetic analysis of H3 subtype influenza virusesisolated from domestic ducks in northern China during 2004-2005，VirusGenes，I10.1007/s 11262-008-0300-7)(中国农业大学)的cDNA为模板，用引物M上游和M下游PCR扩增M基因片段。

反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

pGBD-EGFP-Vector用EcorV内切酶酶切线性化，回收线性化的pGBD-EGFP-Vector。

酶切体系如下：

10×D buffer10μl，BSA 1μl，EcoR V 2μl(20U PROMEGA公司)，pGBD-EGFP-Vector 50μl，补水至100μl，37℃酶切过夜。

酶切产物在1×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收试剂盒回收目的片段。

50μl感受态细胞中加入线性化的pGBD-EGFP-Vector和M基因片段后混匀，线性化的pGBD-EGFP-Vector和M基因片段质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pGBD-M-EGFP-Vector。

2)绿色荧光蛋白的的检测

取10ul lipofectamine 2000(Invitrogen公司)加入到250ul的OPTI-MEMI培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1；将5ugpGBD-M-EGFP-Vector质粒和pGBD-EGFP-Vector质粒分别加入到250ul的OPTI-MEMI培养基中，获得溶液2和溶液3；将溶液1和2混合，室温孵育20分钟，再加入500ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液4；将溶液1和3混合，室温孵育20分钟，再加入500ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液5。

将293T细胞置于6孔细胞板中培养，等待细胞长至60％时将细胞用PBS洗涤两次，然后分别加入溶液4和5，37℃孵育5个小时，分别吸出溶液4和5，加入新鲜的OPTI-MEMI培养基，继续培养。培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。

以pEGFP-N1质粒转染的293T细胞作为阳性对照，未转让任何质粒的293T为阴性对照。

荧光显微镜结果如图2所示，pGBD-M-EGFP-Vector转染后24小时293T细胞(图2A)有较强的荧光信号，阳性对照(图2B)也有荧光出现，而阴性对照组(图2D)与转染pGBD-EGFP-Vector质粒的细胞(图2C)没有荧光，说明pGBD-M-EGFP-Vector可以共表达外源蛋白与绿色荧光蛋白，具有良好的蛋白表达能力，但是pGBD-EGFP-Vector质粒不会表达绿色荧光蛋白，只有插入外源没有终止子的基因后才能表达绿色荧光蛋白，有利于区别空载体与插入外源基因的载体。

序列表

<110>中国农业大学

<120>融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用

<130>CGGNARW92032

<160>1

<210>1

<211>3745

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1