改良超高效液相色谱串联质谱法测定25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3

摘要

目的 建立可同时区分3-epi 25-羟基维生素D3[3-epi 25 (OH) D3]、25-羟基维生素D3[25(OH) D3]和25-羟基维生素D2[25(OH) D2]的改良超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS).方法 采用甲醇、硫酸锌沉淀蛋白,以稳定同位素为内标,正己烷提取,色谱采用甲醇和水以一定比例进行梯度洗脱,质谱采用正离子条件下多离子反应监测模式,3-epi 25 (OH) D3和25 (OH) D3的定量离子通道质荷比(mass to charge,m/z)均为413.3→395.3,25 (OH) D2的m/z为401.4→383.4;同位素内标25 (OH) D2-d3和25(OH) D3-d3的m/z分别为416.3→398.3和404.4→386.4.25 (OH) D3和25 (OH) D2分别以各自的标准品和同位素内标制作标准曲线;3-epi 25(OH) D3采用25 (OH) D3的标准曲线和内标.评价方法的线性、精密度和准确度等,同时用本法和常规UPLC-MS/MS测定307例临床样本,考察方法的一致性,判别3-epi 25(OH) D3对常规UPLC-MS/MS测定结果的影响.结果 本法可在13 min内将3-epi 25(OH) D3、25 (OH) D3和25 (OH) D2完全区分开,3种物质互不干扰,线性相关系数(r) ＞0.999,25 (OH) D3总变异参数(CV)的均值(范围)为2.82％(2.45％～3.21％),批内CV为1.82％ (1.76％ ～ 1.91％);25 (OH) D2总CV的均值(范围)为4.34％ (2.88％ ～ 7.01％),批内CV为2.62％(1.91％～3.66％).25 (OH) D2、25 (OH) D3和3-epi 25 (OH) D3的准确度分别104.5％ ～ 106.8％、98.9％ ～106.9％、108.0％ ～ 109.9％.随机测定307例临床样本,结果显示样本3-epi 25(OH) D3浓度均在3.0 ng/mL以下,本法和常规UPLC-MS/MS分析25-羟基维生素D[25(OH) D]的结果分别为15.53±8.58和(15.98±9.08)ng/mL,偏差为-0.46 ng/mL,百分偏差为-2.44％,2种方法的结果差异无统计学意义(=0.631,P=0.53),R2=0.978.用本法测定得到的维生素D不足、缺乏和充足率分别为76.9％、14.3％、8.8％,常规法的结果分别为75.6％、15.3％、9.1％,2种方法对临床判定的一致率达94.1％,3-epi 25(OH) D3对临床常规UPLC-MS/MS基本无影响.结论 成功建立了可同时区分3-epi 25(OH) D3、25 (OH) D3和25(OH)D2的改良UPLC-MS/MS,该法准确、特异,为评价临床常规UPLC-MS/MS及自动化免疫分析25(OH)D的方法提供了方法学基础.