含PR结构域的锌指蛋白5特异性小干扰RNA载体构建及干扰效果评价

摘要

目的 构建含PR结构域的锌指蛋白5(PRDM5)特异性小干扰RNA(siRNA)干扰载体并鉴定其干扰效果.方法 根据小鼠PRDM5基因全长cDNA序列,设计合成6条siRNA干扰片段(siPRDM5-1、siPRDM5-2、siPRDM5-3、siPRDM5-4、siPRDM5-5和siPRDM5-6)和2条对照序列(siCTL-1和siCTL-2),并将前3条干扰片断和siCTL-1克隆插入pSilencer3.1-U6,另3条干扰片断和siCTL-2插入pSilencer4.1-CMV干扰载体中,构建小鼠PRDM5基因的siRNA真核表达载体siPRDM5-1、siPRDM5-2、siPRDM5-3、siPRDM5-4、siPRDM5-5和siPRDM5-6,2个对照序列siCTL-1和siCTL-2,并通过双酶切和测序进行验证,构建成功后转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10并采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测其干扰效率.结果 成功构建真核siRNA表达载体,并且所构建的6个干扰载体均可降低小鼠黑色素瘤细胞中PRDM5基因mRNA表达(P＜0.05).其中siPRDM5-2和siPRDM5-6载体干扰效果最好.结论 成功筛选出PRDM5特异性siRNA载体,为之后研究锌指蛋白基因PRDM5在小鼠黑色素瘤转移过程中功能及分子机制打下基础.