小麦胚乳特异性多酚氧化酶基因RNA干扰载体的构建及遗传转化

摘要

面粉中的多酚氧化酶是造成面团褐变的主要因素之一，通过转基因技术阻断或降低ppo基因的表达，对于提高面制品的白度，具有重要意义。而探索和建立具有取材方便、无受体基因型限制、简单高效的农杆菌转化体系，是实现小麦转基因技术突破的关键。本论文包含两部分研究内容：一是高效农杆菌转化体系的建立；二是构建小麦胚乳特异表达的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo)基因的RNA干扰载体，并利用农杆菌介导技术将其转入普通小麦。
　　 1.高效农杆菌转化体系的建立 使用取材方便的成熟胚作为转化受体，操作方法简单，不经过愈伤组织的过程，实验周期短，且阳性率高。注射转化法转化小麦总阳性率为78.1％，穗部阳性率为73.2％；针刺转化法转化小麦总阳性率为59.8％，穗部阳性率为51.9％。K35使用针刺法和注射法转化总阳性率74.2％，穗部阳性率为53.6％；济引1号分别使用针刺法和注射法进行转化总阳性率65.7％，穗部阳性率为76.9％。未萌动时转化阳性率为67.7％，穗部阳性率为63.6％；籽粒萌动时转化阳性率为69.7％，穗部阳性率为65.2％；有芽时转化阳性率为72.1％，穗部阳性率为65.9％。所以使用济引1号为转化受体，在籽粒有芽时采用注射法转化效果更好。
　　 2.载体构建 本研究选用ppo基因的第三外显子为靶序列，goujianle含有胚乳特异性启动子Bx17和ppo基因的特异性RNA干扰表达盒的中间载体pZlbx-ppoRNAi。通过选用合适的酶切位点，酶切连接构建得到中间载体pBluippo和pBluippopBIOS，然后将pBluippopBIOS中含Bx17和ppo基因的RNA干扰表达盒整合到含Ac/Ds转座子系统的pBIOS1952载体上，构建得到能有效去除筛选标记基因的ppo特异性干扰的农杆菌表达载体piPPO。
　　 3.piPPO农杆菌载体转化小麦 将含有piPPO载体的农杆菌利用农杆菌介导方法对500个正在生长中的幼胚进行转化，在幼胚和胚乳间紧密接触处注入piPPO农杆菌菌液，经过幼胚培养，G418抗生素筛选及两步再生共得到10株小麦，提取基因组DNA，通过设计合适的引物进行PCR检测，获得5株阳性植株，阳性率1％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词说明

声明

1 前言

2 试验材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间发表的论文