人KIBRA基因真核表达载体的构建及生物信息学分析

摘要

目的 构建人的肾脏脑蛋白(human kidney and brain protein,KIBRA)编码区全长的真核表达载体,为在乳腺癌细胞水平研究KIBRA生物学功能提供模型.方法 提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录后再通过PCR扩增KIBRA(NM_001161661.2)编码区全长,并克隆至真核表达载体pCMV-Blank上,鉴定正确后命名为pCMV-KIBRA.将其转染MCF7细胞,48h后实时定量PCR和Western blotting检测KIBRA的表达.结合生物信息学软件分析KIBRA的一级、二级、三级结构和转录后修饰位点.结果 菌液PCR、双酶切和测序结果 均表明载体pCMV-KIBRA中插入的KIBRA序列正确.载体转染MCF7细胞可使KIBRA的mRNA和蛋白水平显著增高.生物信息学分析KIBRA由1119个氨基酸组成,存在52个磷酸化位点、1个乙酰化位点和5个泛素化位点,且二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲.结论 成功构建人KIBRA编码区全长的真核表达载体,并在乳腺癌细胞系MCF7中过表达,为在乳腺癌中研究KIBRA的生物学功能奠定了基础.