抗弓形虫伴侣蛋白60多克隆抗体制备与鉴定

摘要

目的:制备、鉴定抗弓形虫伴侣蛋白60(TgCpn60)特异性多克隆抗体。方法:以弓形虫RH株cDNA为模板,PCR扩增编码TgCpn60的C末端168个氨基酸(TgCpn60C168AA)的507 bp序列片段,构建pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重组质粒。将鉴定正确的质粒转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21,并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,进而用Glutathione-SepharoseTM4B介质亲和层析法纯化重组蛋白后行SDS-PAGE电泳。以纯化的GST-TgCpn60C168AA蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取小鼠血清进行纯化,获得特异性抗TgCpn60C168AA多克隆抗体。以该多克隆抗体为一抗,进行Western blot检测,验证其与虫体蛋白的反应情况。瞬时转染pFNR-RFP质粒至虫体后,采用间接免疫荧光法(IFA)检测TgCpn60与弓形虫顶质体外腔膜标志蛋白NADP+铁氧化还原蛋白还原酶(TgFNR)的共定位情况。结果:经PCR及测序结果证实重组质粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA构建成功。SDS-PAGE电泳结果表明,GST-TgCpn60C168AA蛋白成功诱导表达。Western blot结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别GST-TgCpn60C168AA重组蛋白,同时也能识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白。IFA结果证实,TgCpn60蛋白与TgFNR蛋白存在共定位现象。结论:制备的抗GST-TgCpn60C168AA重组蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白,为进一步研究该蛋白功能提供了有利的工具。