利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74％、12.36％、12.54％、2.94％.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.