绿色木霉CBHⅡ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

摘要

采用反转录聚合酶链式反应的方法从绿色木霉中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)的编码基因cbh2.将该基因片段接入酿酒酵母整合型表达载体pScIKP中,得到重组质粒pScIKPc-bh2.电转化酿酒酵母菌株,通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子.采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CBHⅡ蛋白的表达,并采用羧甲基纤维素糖化力法检测重组CBHⅡ的酶活.实验结果表明:该基因大小为1 416 bp,编码有472个氨基酸残基,并已将序列提交GenBank,登录号为DQ864992.SDS-PAGE分析发现重组CBHⅡ成功分泌到了胞外,其相对分子质量约为70 000.培养液中的酶活最高可达7.71U/mL,其作用的最适pH值为5.0,最适反应温度为65℃,且具有较好的热稳定性.