原核表达载体pET28a-3×flag-LukS-PV的构建与表达鉴定

摘要

cqvip:目的 构建原核表达载体pET28a-3×flag-LukS-PV,并在大肠杆菌中进行表达纯化及鉴定。方法 通过PCR扩增得到LukS-PV基因和3×flag基因,经琼脂糖凝胶电泳分离切胶回收后与pMD-18T载体连接。通过NdeⅠ和Bam HⅠ对pMD-18T-3×flag载体和pET28a载体进行双酶切后,连接得到pET28a-3×flag载体。使用Bam HⅠ和XhoⅠ分别对pET28a-3×flag载体和pMD-18T-LukS-PV进行双酶切,连接后得到pET28a-3×flag-LukS-PV重组质粒并测序鉴定,随后转化入大肠杆菌BL21中。利用SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析并使用抗His单克隆抗体和抗flag多克隆抗体进行Western blot检测。结果 PCR获得了LukS-PV和3×flag基因,构建的pET28a-3×flag-LukS-PV重组质粒经测序鉴定无碱基突变。SDS-PAGE电泳表明重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,且重组蛋白浓度和纯度均较高。Western blot表明使用抗His单克隆抗体和抗flag多克隆抗体在约40 kD均可产生特异性浓集条带。结论 成功纯化得到了高浓度和高纯度的3×flag-LukS-PV重组蛋白,为后续研究LukS-PV的生物学功能和具体机制奠定了基础。