小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

摘要

目的 构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG(Puro-IRES-GFP)的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定.应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3μg/mL嘌呤霉素(puromycin),连续7 d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCVPIG-OIF-3FLAG的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达.结果 构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的 基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达.结论 成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株.