人卵巢组织玻璃化冻存方案优选的实验研究

摘要

目的 评价4种玻璃化冷冻保存液对人卵巢组织的冻存效果,以筛选出较优的玻璃化冷冻保存液配方.方法 收集2018年3月至2019年12月期间在北京大学深圳医院妇科因疾病手术治疗的4例患者的卵巢组织,将人卵巢分割为(5～10)mm×10 mm×1 mm大小的组织块进行玻璃化冷冻保存,根据玻璃化冷冻保存液组成成分不同将组织块随机分为4组[A组为20％ 乙二醇(EG)+20％ 二甲基亚砜(DM SO)+0.5 mol/L蔗糖+20％ 人工合成血清替代品(SSS)+M199培养基;B组为38％EG+0.5 mol/L海藻糖+6％SSS+M199培养基;C组为15％EG+15％DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20％SSS+M199培养基;D组为商品化Cryotissue Kit VT301/VT302成品]以及对照组(未经冻融处理的新鲜卵巢组织).采用液氮液滴法在显微镜下观察4种保存液在快速降温和复融时的玻璃化状态;HE染色比较冻存后各组卵巢组织形态学改变;采用免疫组化法检测各组中凋亡标志物细胞色素C(Cytochome C)与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况.结果 液滴法检测发现,在液氮中快速降温时A、B和D组冻存液均能保持完全玻璃化状态,C组冻存液呈部分结晶;在复融过程中,A、B和C组冻存液均出现结晶,D组冻存液则绝大部分保持透明的玻璃化状态.HE染色结果发现,A、B、C和D组人卵巢组织中的正常卵泡率与对照组比较均无显著性差异(P>0.05);免疫组化结果显示,D组和对照组卵泡中Cytochome C显著低于C组(P<0.05),C组卵泡Caspase-3阳性率显著高于其他组(P<0.05).结论 通过液氮液滴法观察冻存液在快速降温和复融时的玻璃化状态方便直观,可用于对人卵巢组织玻璃化冷冻液的初步筛选;商品化Cryotissue Kit V T 301/V T 302冻存液冻融后人卵巢组织细胞凋亡较少,为较优的冻存液配方.