结核分枝杆菌标本的不同处理方法对PCR扩增敏感性的影响

摘要

目的探讨检测标本中血红蛋白(Hb)浓度对PCR扩增管中Taq酶活性的影响及消除影响的方法;探讨胰酶消化痰液的应用价值;比较淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、十二烷基硫酸钠(SDS)溶血液处理全血标本对检测结果敏感性的影响;观察SDS在结核分枝杆菌DNA(TB DNA)提取液中存在的价值及对Taq酶的影响.方法将经梯度稀释的Hb标准品与结核分枝杆菌(TB)定值质控品混匀制备成待检标本进行PCR检测;将定值Hb标准品与TB质控品混匀制备成待检标本,观察提取时100℃煮沸时间对Hb抑制Taq酶能力的影响;将结核患者的痰液分成两管,分别用4 g/dl NaOH消化、1 g/dl胰酶消化、1 g/dl胰酶消化+4 g/dl NaOH处理,比较PCR检测结果的敏感性;将结核患者的外周抗凝血分别用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、SDS溶血剂处理,比较PCR检测结果的敏感性;用10 g/LSDS、1%(v/v)Triton、1 g/LSDS的1%(v/v)Triton、0.5 g/L SDS的1%(v/v)Triton提取液对相同的TB质控品进行TB DNA提取,观察PCR检测结果敏感性;56份痰液、34份全血按痰液、全血标本的方法处理,进行PCR扩增,比较检测结果的阳性率.结果当Hb≥10-5g/L时,Hb对Taq酶的抑制作用随其浓度的增加而增强;提取时100℃煮沸40 min与煮沸10 min的对照管结果完全一致;痰液标本处理方法的敏感性顺序为:胰酶消化+NaOH处理＞胰酶消化＞NaOH消化;全血标本处理方法的敏感性顺序为:红细胞裂解液法=淋巴细胞分离法＞SDS溶血法;提取方法PCR检测结果敏感性顺序为:0.5 g/L SDS的1%(v/v)Triton＞1%(v/v)Triton＞1 g/L SDS的1%(v/v)Triton＞10 g/L SDS,SDS对Taq酶的抑制作用随其浓度的增加而增强.56份痰标本按上述方法处理的阳性率分别为57.1%(32/56),82.1%(46/56),91.0%(51/56),通过配对资料卡方检验,胰酶消化和胰酶消化+NaOH处理与NaOH消化法之间具有显著性差异(P＜0.005),胰酶消化和胰酶消化+NaOH处理之间差异无显著性(0.1＜P＜0.25);34份全血标本按上述方法处理的阳性率分别为79.4%(27/34),79.4%(27/34),47.0%(16/34),通过配对资料卡方检验,红细胞裂解液法和淋巴细胞分离法与SDS溶血法之间具有显著性差异(0.005＜P＜0.01).结论检测TB DNA标本的预处理有必要规范化.