丙型肝炎病毒高水平复制细胞株的构建及其机制初步研究

摘要

旨在探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)cured细胞株的易感机制.本研究将体外转录的HCV RNA电转入肝癌细胞系Huh 7细胞,建立HCV复制子细胞株,用γ-干扰素(interferon,IFN)处理复制子细胞株,获得HCV cured Huh 7A和Huh 7B细胞株.用插入报告基因的HCV毒株Jc1-G感染上述细胞株,分别进行荧光素酶活性测定、蛋白质印迹法和荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测以验证其易感性.收集Huh 7、Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B细胞并利用IFN-α处理,之后用蛋白质印迹法及荧光定量PCR进行检测,验证细胞株中IFN诱生信号通路中关键因子内源性表达及抗病毒活性ISGs的激活水平.结果显示,在Huh 7A和Huh 7B细胞中检测不到病毒RNA,与Huh 7细胞一致.病毒感染实验中,与Huh 7细胞相比,Huh 7A和Huh 7B细胞株中荧光素酶活性增高百倍,病毒蛋白表达和RNA水平亦显著上调,与Huh 7.5细胞株中的表达水平接近.IFN信号通路实验中,与Huh 7细胞相比,Huh 7A和Huh 7B细胞株中RIG-I/MDA5/MAVS内源性蛋白表达和mRNA水平无明显差异;IFN-α处理细胞后IFN刺激基因isg56,mx1,mx2,oax1,oax2,viperin,cxcl10,ifitm1和ifitm3激活水平亦无显著变化.结果提示,本研究制备的Huh 7A和Huh 7B细胞株可支持HCV高水平复制,将为研究病毒复制机制提供有力的支持.