干扰素诱导蛋白Viperin抑制丙型肝炎病毒复制机制的初步研究

摘要

丙型肝炎病毒(HCV)隶属于黄病毒科丙型肝炎病毒属,其基因组为单正链线状的RNA。对于HCV的复制机制,一般认为与其它黄病毒属成员及单正链RNA病毒相似,即病毒进入细胞并脱衣壳之后首先在胞浆或胞浆特定膜结构内翻译产生病毒蛋白,这些病毒蛋白再通过与宿主细胞蛋白的相互作用对宿主的特定膜结构进行改造,形成膜相关的复制复合体。α干扰素(IFN-α)是目前临床使用的治疗慢性丙型肝炎患者的有效药物之一,与细胞表面相应受体结合后激活JAK-STAT级联信号放大系统,通过与ISRE结合后引起相应效应蛋白的表达。目前已知,蛋白激酶R(PKR)、2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5 OAS)、载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)等作用于病毒生活周期的不同阶段,抑制了病毒的入胞、脱衣壳、翻译、RNA的复制以及病毒粒子的包装、成熟、释放。尽管如此,对大多数干扰素诱导蛋白的抗病毒作用机制,目前仍不十分清楚。
　　 Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的,在进化上高度保守的干扰素诱导蛋白。2005年,Karla.Helbig等人首次报道在体外HCV亚基因组复制子(Replicon)系统中,Viperin可以抑制HCV病毒的复制,并且发现在所有检测的慢性HCV感染病人的肝穿标本中Viperin都呈现高水平表达,提示Viperin在机体抑制HCV病毒感染中发挥重要作用。但对于Viperin的抑制HCV病毒复制的作用机制仍然了解较少,有待进一步研究。
　　 为此,本研究首先对Viperin抑制HCV复制的效应进行了验证。通过在Replicon细胞中转染不同剂量的Viperin,发现可以剂量依赖的方式下调内源性HCV RNA及非结构蛋白NS5A的水平。接着,在感染性HCVcc系统中对这一现象进行了进一步的验证,对于Huh-7.5细胞,在用JFH-1病毒感染之前转染表达Viperin,发现可以相类似的方式抑制细胞内新生的HCV RNA和非结构蛋白NS3的水平。进一步利用免疫荧光分析技术,观察Viperin对内源性HCV非结构蛋白NS5A的作用.通过在Replicon细胞中分析Viperin转染之后NS5A阳性率,发现在转染后30小时,Viperin即可明显下调NS5A的阳性率,60小时后下调作用更加明显,当在Replicon细胞中转染Viperin之后60小时,很难观察到Viperin和NS5A同时存在于同一个细胞.同时应用Western blotting检测NS5A的表达量,和这一现象相吻合,确认Viperin对于Replicon细胞中NS5A下调作用。
　　 最近,Viperin被证实可以通过和FPPS相互作用并抑制后者的酶活性,进而破坏脂筏膜的正常结构,增加脂筏的流动性,从而抑制流感病毒(Influenza virus)从胞浆膜上的释放。如上所述,HCV病毒也在脂筏膜结构上进行RNA的复制,由此可以假设Viperin是否是通过同样或者相类似的机制发挥其抑制HCV复制效应。为此,对转染Viperin的Replicon细胞进行membrane flotation analysis,探讨HCV非结构蛋白与脂筏的关联程度是否受到影响。发现和转染空载体的对照组相比,转染Viperin后,部分NS3和NS5A蛋白进入到高密度区域,而用脂质删除试剂mβ CD处理时,大部分HCV的非结构蛋白NS3也都位于高密度区。该结果提示Viperin可能破坏了HCV的非结构蛋白与脂筏膜的关联程度。而对于Viperin的这种破坏作用,目前至少有两种可能的解释:一是Viperin直接作用于细胞内脂阀膜结构,进而干扰了同样位于其上的HCV复制复合体的稳定性或者(和)组成；二是Viperin干扰了HCV复制复合体形成过程中的病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用,进而导致了HCV复制复合体形成的障碍。
　　 接下来对于两种可能的机制进行了分别的探讨。对于第一种可能机制,首先探寻Viperin的这种效应是否是特异性地针对HCV的非结构蛋白,通过分析Viperin过量表达情况下,脂筏标记分子Flotillin-2与脂筏膜的关联程度,结果发现与HCV的非结构蛋白相类似,Viperin的表达使得部分Flotillin-2进入到高密度区。上述结果提示,Viperin的表达使得部分原先和脂筏相关联的蛋白分子(包括HCV非结构蛋白和脂筏标记分子Flotillin-2)对非离子去污剂敏感而更容易从脂筏上脱落,这可能由Viperin引起脂筏膜结构的改变或者破坏所造成。
　　 随后,通过免疫荧光的方法分析了Viperin对于同样位于脂筏上的HCV复制复合体的影响。结果发现,与对照组中hVAP33与内源性的NS5A存在细胞内共定位相比,Viperin在细胞内表达后,hVAP33从对照组的均匀核周分布变成聚集的点状分布,并且和NS5A的共定位消失。
　　 最后,通过共转不同比例的Viperin和FPPS的表达质粒,发现FPPS对于Viperin的抗HCV病毒活性存在着部分的回复作用,这就提示Viperin对于脂筏的破坏作用可能是通过抑制胆固醇的生物合成,进而干扰了脂筏的正常微结构或者功能实现的。
　　 对于第二种可能机制,首先通过免疫荧光以及细胞内免疫共沉实验,发现Viperin可以和宿主蛋白hVAP-33的Coiled-coil结构域相互作用,提示了Viperin可能对病毒蛋白NS5A和hVAP-33之间的相互作用产生一定的影响。随后利用细胞内免疫共沉的方法,通过计算被沉淀的NS5A/NS5B的量与总的hVAP-33的量的比值,发现当有Viperin表达时,hVAP-33结合NS5A的效率约为对照组的40％,而同时hVAP-33结合NS5B的效率约为对照组的80％。这就提示了Viperin可能主要与HCV非结构蛋白NS5A竞争结合宿主蛋白hVAP-33。
　　 综上所述,本研究发现Viperin一方面可能通过抑制脂筏的组成成分胆固醇的生物学合成,干扰细胞内脂筏的正常微结构或者功能,影响了位于其上的HCV的复制复合体的稳定性或者组成,另一方面可能通过与HCV的NS5A蛋白竞争结合宿主蛋白hVAP-33从而影响了HCV复制复合体的形成,发挥了抑制HCV复制的效应。上述发现对于Viperin抑制HCV病毒的复制的机制提出了一种可能的解释,有助于对HCV病毒的复制的认识和研制新型抗病毒药物。