脂多糖诱导成年大鼠心室肌细胞线粒体融合-分裂动力失衡模型的构建

摘要

目的:探讨脂多糖(LPS)在体外诱导成年大鼠心室肌细胞线粒体融合-分裂动力失衡模型的构建方法.方法:Sprague-Dawley大鼠异氟烷麻醉后胸部正中切口取出心脏并连接于心脏灌流装置,用II型胶原酶(质量浓度为0.3 mg/mL)沿升主动脉逆行灌注消化分离心肌细胞,心肌细胞终止消化并复钙后进行逐级沉淀,加入M199(medium 199)培养基进行培养.对照组采用M199培养基培养,模型组用含有不同质量浓度的LPS(10～1000 ng/mL)培养.用免疫荧光染色方法标记心室肌细胞肌钙蛋白来观察心肌细胞的形态结构,并用不同质量浓度的LPS刺激心肌细胞,TUNEL法和AnnexinV/PI双染法检测心肌细胞凋亡情况,免疫荧光法测定心肌细胞中caspase-3和caspase-9的活性,Western blotting法测定心肌细胞Bax、Bcl-2、细胞色素c(Cyt c)和线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)以及线粒体分裂蛋白1(Fis1)和线粒体动力蛋白1(Drp1)的含量.结果:免疫荧光染色显示培养的为长杆状存活的心肌细胞.与对照组相比,LPS诱导心肌细胞24 h,心肌细胞凋亡阳性细胞数和caspase-3和caspase-9活性较对照组显著增高;LPS组心肌细胞线粒体中促凋亡蛋白Bax及胞浆中Cyt c显著增高,而胞浆中抗凋亡蛋白Bcl-2显著降低;线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1含量明显减少,而线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1显著增多.结论:质量浓度为10 ng/mL的LPS可以显著诱导体外培养成年大鼠心室肌细胞线粒体融合-分裂动力失衡模型的建立.