RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立

摘要

目的:构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据.方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLY[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR (qPCR)和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平.结果:酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1,实验组慢病毒的滴度为3×108TU·mL-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95％以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高(P＜0.01);Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高(P＜0.05).结论:成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLY[Exp] EGFP RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系.