pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达

摘要

目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxa质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测.方法:用Sal Ⅰ和Not Ⅰ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中.获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达.结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒.重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性.EcDR Ⅰ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;Xba Ⅰ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp的条带,符合预计大小.Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处(PIASxβ融合蛋白)有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符.结论:成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础.