酿酒酵母无机焦磷酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其意义

摘要

目的:利用大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶(Y-IPPA),获得具有活性的酿酒Y-IPPA.方法:以酿酒酵母基因组为模版,通过查询NCBI获得酿酒酵母无机焦磷酸酶序列,设计引物,用PCR方法获得酿酒Y-IPPA基因序列,插入克隆性载体pMD(R) 19-T Simple Vector中,并转化至大肠杆菌DH5α扩增,获得重组质粒,经酶切及测序验证正确后,将酶切的目的片段插入到原核表达载体p ET28 (a)中,再转化大肠杆菌DH5α扩增,经酶切及测序验证正确后,转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达蛋白,通过IPTG诱导表达出Y-IPPA,以金属离子亲和层析蛋白纯化系统纯化蛋白,并测定其比活和酶学性质.结果:获得与pMD(R) 19-T SimpleVector一致的Y-IPPA碱基序列,构建了重组表达质粒pET28 (a) -Y-IPPA,并转化大肠杆菌BL21 (DE3),以IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为32 000处可见Y-IPPA蛋白条带；镍柱亲和层析纯化目的蛋白,其中一组的蛋白浓度、活性和比活分别为0.312 g·L-1、31.13 units·mL-1和99.73 uints·mg-1.结论:成功制备Y-IPPA蛋白,为进一步研究其酶学性质奠定了基础.