酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因和3-磷酸甘油酯酶基因在大肠杆菌中的共表达

摘要

作为改造代谢途径获得直接转化葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌的第一步,该论文对产甘油基因工程菌的构建做了以下研究.首先,从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)和3-磷酸甘油酯酶(HOR2)基因,分别构建重组质粒pSE-gpd1和pSE-hor2,然后进行两种重组基因的表达试验,一种是双表达盒法,另一种是多顺反子法.在第一种表达法中含双表达盒的重组E.coli JM109菌株在含1％葡萄糖的摇瓶发酵培养基中于37℃培养24小时,有甘油产生,产甘油率为1.18g/L.在第二种表达方法中以JM109为宿主的含多顺反子的重组菌株在含1%葡萄糖的摇瓶发酵培养基中于37℃培养24小时,有甘油产生,产甘油率为3.79g/L.而以BL21作为宿主时,重组菌株发酵罐发酵28小时,产甘油率为22.64g/L,葡萄糖的转化率为45.3%研究结果表明:将gpd1和hor2基因引入大肠杆菌,在大肠杆菌中构建了一条可将葡萄糖直接转化成甘油的新的代谢途径是可行的.同类研究在国内尚无报道.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1利用酵母生产甘油

1.2利用大肠杆菌生产甘油

第二章含3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpdl)和3-磷酸甘油酯酶基因(hor2)双表达盒的质粒的构建

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2酶与试剂

2.1.3主要仪器设备

2.2方法与步骤

2.2.1酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的复苏培养

2.2.2酿酒酵母菌种的保存

2.2.3酿酒酵母染色体DNA的制备

2.2.4 3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpdl)和3-磷酸甘油酯酶基因(hor2)的引物设计和PCR扩增

2.2.5大肠杆菌感受态的制备

2.2.6质粒DNA的大量制备

2.2.7质粒DNA的小量制备

2.2.8 DNA的酶切与连接

2.2.9连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞

2.2.10 阳性克隆的筛选和酶切验证

2.2.11 多克隆位点的缺失

2.2.12 gpdl基因的表达盒的PCR扩增

2.2.13 hor2基因的表达盒的PCR扩增

2.2.14外源片段在大肠杆菌中的诱导表达

2.2.15表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.16含双表达盒的重组大肠杆菌JM109摇瓶发酵实验

2.3结果与分析

2.3.1 S.cerevisiae总DNA的制备

2.3.2 3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpdl)表达质粒的构建

2.3.3.3-磷酸甘油酯酶基因(hor2)表达质粒的构建

2.3.4含两个表达盒的质粒的构建

2.3.5含双表达盒的重组大肠杆菌JM109摇瓶发酵实验

2.4讨论

第三章含3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpdl)和3-磷酸甘油酯酶基因(hor2)多顺反子的表达质粒的构建

3.1材料

3.2方法与步骤

3.2.1 3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpdl)的引物设计和PCR扩增

3.2.2 3-磷酸甘油酯酶基因(hor2)的引物设计和PCR扩增

3.2.3 DNA的酶切

3.2.4 DNA的连接与转化

3.2.5阳性克隆的筛选和酶切验证

3.2.6外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

3.2.7蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.8含多顺反子的重组大肠杆菌JM109摇瓶发酵实验

3.2.9含多顺反子的重组大肠杆菌BL21发酵罐发酵实验

3.3结果与分析

3.3.1 gpdl基因的克隆

3.3.2 hor2基因的克隆

3.3.3含多顺反子的表达质粒的构建

3.3.4表达产物的SDS-PAGE分析

3.3.5含多顺反子的重组大肠杆菌JM109摇瓶发酵实验

3.3.6含多顺反子的重组大肠杆菌BL21发酵罐发酵实验

3.4讨论

第四章结论与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文