甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立

摘要

根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys).采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切.将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体.将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中.筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功.