Cdc2/cdk1和survivin特异性siRNA真核表达载体的设计、构建和鉴定

摘要

目的:构建表达靶向cdc2/cdk mRNA和survivin mRNA的siRNA真核表达质粒.方法:从GenBank中搜索Cdc2/cdk1和survivin基因组标准序列,根据siRNA设计原理构建siRNA真核表达质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivin-shRNA.phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2、pU6-HK-shRNA质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和酶切位点,而phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2均含有红色荧光基因作为报告基因和酶切位点.质粒酶切、电泳、测序鉴定;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞,荧光显微镜下观察、摄片、计数阳性细胞,计算转染效率,激光共聚焦显微镜检测质粒载体绿色和红色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测真核表达质粒对相应蛋白的抑制率.结果:荧光显微镜下计算转染效率显示在转染鼻咽癌细胞CNE2 48 h转染率高达45.00％～57.45％;质粒phU6 cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin shRNA1、phU6-survivin-shRNA2和pU6-HK shRNA酶切后均可见400 bp条带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达相应荧光;免疫印迹检测phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivin-shRNA2对鼻咽癌CNE2细胞相应蛋白抑制率分别是33.00±1.41、38.31±1.01 (survivin)、36.33±1.21和43.26±1.02(cdk1).结论:本实验构建了靶向Cdc2/cdk1mRNA和survivin mRNA的真核表达质粒.重组质粒能有效转染人鼻咽癌细胞,phU6-cdc2/cdk1-shRNA2和phU6-survivin-shRNA2与phU6-cdc2/cdk1-shRNA1和phU6-survivin-shRNA1相比,转染CNE2 48h后其对相应蛋白的干扰率相对较高.