CYP3A4和CYP1A2及CYP2E1快速免疫印迹检测方法的建立

摘要

目的:建立细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)、1A2(CYP1A2)及2E1(CYP2E1)的快速免疫印迹(Western blot)检测方法。方法:培养HepG2细胞并提取总蛋白,饲养大鼠并制备肝组织匀浆液、S9以及微粒体,以4种标本为对象分别以不同的封闭时间、抗体孵育时间和分离胶类型等常规Western blot条件设置A、B、C、D、E及F组用以考察CYP3A4的最佳检测条件;使用Western blot快速孵育仪,分别以不同的Western blot封闭和抗体孵育时间条件设置A、B、C和D、E、F及G、H、I组分别用以考察CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1的最佳检测条件。结果:常规Western blot不同条件下,对CYP3A4的检测中C组检测灵敏度在HepG2、肝微粒体样品检测中高于A、B、D、E及F组(P<0.05),在组织匀浆、S9样品检测中C组检测灵敏度高于A、B、E组(P<0.05);在使用Western blot快速孵育仪孵育条件下,对CYP3A4的检测C组灵敏度在HepG2、肝组织匀浆及S9样品检测中高于A、B组(P<0.05),在肝微粒体样品检测中高于B组(P<0.05);对CYP1A2的各组样品检测中,F组的检测背景干净、条带的均一性均优于D、E组;对CYP2E1检测显示,在肝组织匀浆、S9及肝微粒体样品中I组的检测灵敏度高于G、H组(P<0.05)。结论:与常规检测条件相比,改进后的Western blot封闭孵育方式能够有效地对CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1进行快速检测,缩短了封闭孵育的时间。