草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的表达分析及多克隆抗体制备

摘要

为进一步开展草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的生物学功能研究准备实验材料,同时探讨并构建一种草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法。实验构建了VP38的原核表达质粒pET28a-VP38,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)诱导表达,8 mol/L尿素溶解重组蛋白后免疫小鼠,制备鼠抗VP38多克隆抗体;利用制备的抗体探究Grass carp reovirus 104(GCRV-104)感染后VP38在翻译水平的表达动力学;利用Western blot、间接免疫荧光分析(IFA)对抗体进行评估;构建VP38的真核表达载体pEGFP-N1-VP38,转染至草鱼性腺(Grass carp ovary,GCO)细胞内进行亚细胞定位分析。结果显示:重组VP38蛋白在原核表达系统中以包涵体形式存在;制备的鼠抗VP38多克隆抗体既能够识别重组VP38蛋白,也能够识别GCO细胞感染GCRV-104后表达的VP38蛋白;GCRV-104感染后72h VP38主要分布在细胞质中,与亚细胞定位结果一致;VP38在感染的前期微量表达,感染中后期大量表达。本研究制备的鼠抗VP38多克隆抗体具有较高的效价和较好的特异性,为构建草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法提供了较好的技术路线。