FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶发酵、纯化及酶学性质

摘要

细菌来源的FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)较为罕见,作者利用乳糖为诱导剂,发酵E.coli BL21(DE3)生产FAD-GDH。7.5 L发酵罐中培养该菌,通过分批补料,分阶段温度控制,酶活达到1341 U/L,菌体量达12.4 g/L。通过镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱三步层析对粗酶液分离纯化,获得比酶活109 U/mg的重组酶。SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组蛋白质纯化后呈单一条带,相对分子质量约60000。等电聚焦电泳检测酶的等电点pI为5.3。酶标仪全波长扫描吸收光谱表明,该酶的辅基为FAD,与酶非共价键结合。相比其它糖类,以葡萄糖为底物酶的Km最小,为2.56 mmol/L,kcat/Km为3487.7 L/(mmol·s)。该酶在pH 5.5~8.0内稳定,最适反应pH 7.0,当pH高于8.0时酶活迅速降低。差式扫描量热分析(DSC)测得酶的Tm值为77℃,热稳定性良好。本研究为该酶的进一步工业化生产应用提供参考与借鉴。