葡萄糖脱氢酶

摘要： 目的 对重组葡萄糖脱氢酶(rGDH)酶学性质进行研究。方法 对rGDH进行纯化,取纯化后的rGDH,测定其最适反应温度、最适pH、金属离子耐受性、有机溶剂耐受性、底物偏好性、辅酶依赖性、米氏常数(K_(m))等酶学特征。结果 经测定rGDH的最适反应温度为40°C,最适反应pH为10.5,对D-葡萄糖的K为0.3 mol/L,该酶只耐受特定有机溶剂,大部分金属离子对其酶活有促进作用,且具有较强的底物特异性,是一种NAD^(+)、NADP^(+)双辅酶依赖型酶,但对NAD^(+)具有更强的亲和力。结论 本研究筛选并表达得到耐碱的rGDH,解决了大规模酶法制备熊去氧胆酸反应中辅酶再生问题,降低了生产成本。

摘要： 为提高L-苯乳酸(L-phenyllactic acid,L-PLA)的生产效率,以干酪乳杆菌Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶突变体L-LcLDH1Q88A/I229A为研究对象,实现其在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的分泌表达,并与葡萄糖脱氢酶SyGDH偶联,构建并优化体外辅酶循环体系,不对称还原苯丙酮酸(Phenylpyruvate,PPA)制备L-PLA.结果 显示,毕赤酵母重组酶reLcLDH1Q88A/I229A的表观分子量为36.8 kDa,比活力为270.5 U/mg,是原酶的42.9倍.在40°C,初始pH为5.0,底物PPA、辅酶NAD+和葡萄糖浓度分别为100、2和120 mmol/L,SyGDH和reLcLDH1Q88A/I229A添加量分别为1和10 U/mL的最优条件下,L-PLA的产率可达99.8％,对映体过量(ee)值＞99.9％,时空产率和平均转化率分别高达9.5 g/(L·h)和257.0 g/(g·h).结果 表明,reLcLDH1Q88A/I229A在不对称还原PPA制备L-PLA中生产效率高,具有工业应用的潜力.

摘要： 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH,EC1.1.5.9),具有辅基结合紧密、催化效率高的优点,可替代目前诊断用葡萄糖氧化酶应用于血糖指标的临床生化检测.本文选取Burkholderia cepacia的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)构建表达质粒pTrc99a-gdh,转化E.coli BL21(DE3).异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导发酵,通过酶活测定及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,获得可溶性表达的FAD-GDH,分子量约为60000.利用乳糖替代IPTG作为诱导剂,摇瓶水平初步探索诱导条件,酶活达到994U/L.7.5L发酵罐放大培养该菌,采用梯度流加补料策略,分阶段温度控制,并采用不同的乳糖流加速率进行诱导.当采用0.3mL/min的乳糖流加速率时,酶活达22200U/L,菌体量达69.48g/L.经过镍柱层析,最终获得纯酶的比酶活104.5U/mg.为医用诊断原料用酶葡萄糖脱氢酶新酶种的工业化生产提供借鉴.

摘要： 旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺.利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响.成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95％.该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37°C和pH 8,10％ 以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用.大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础.

摘要： 以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase with FAD,FAD-GDH,EC 1.1.99.10),与辅基结合紧密,催化效率高,是临床检测血糖指标的新型诊断用酶.将Burkholderia cepacia的FAD-GDH基因(gdh)构建含单启动PHpaⅡ的穿梭质粒pMA5-1,在蛋白酶缺陷型菌株Bacillus subtilis WB600中表达.为了获得该酶的高效表达,采用启动子串联及改造策略考察产酶情况.将4种启动子(PamyQ·,P43,PgsiB,Popuaa)分别与质粒上自带的启动子PHpaⅡ串联,结果表明PHpaⅡ-PamyQ·串联组合获得的FAD-GDH胞内酶活最高,为2 497 U/L,是串联前单启动子的2.7倍.为了减少发酵过程中,葡萄糖和甘油对产酶的抑制作用,在串联组合的基础上删去PamyQ·启动子中与碳代谢调控蛋白结合的cre位点,使胞内产酶水平提高至3 626 U/L,说明cre位点的去除能够减少碳代谢产物对启动子转录的抑制.本研究为新型诊断用酶FAD-GDH的菌种改造和工业化生产应用提供参考与借鉴.

摘要： 蚕豆病是由于遗传性红细胞六磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）缺乏,进食蚕豆或蚕豆制品等引起急性血管内溶血.多见于我国广东、广西、湖南、湖北、四川等省份,7岁以下儿童,其中90％为男性患儿.本病通常于每年5月份蚕豆成熟季节流行,哺乳期母亲食用蚕豆后喂奶亦可致婴儿发病,溶血轻重与食蚕豆的量无关.遗传医学研究证实,该病系X伴性不完全显性遗传,即突变基因在X染色体上.男性患儿为杂合子,女性患儿为纯合子,所以男性发病率明显高于女性.

摘要： 吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种新型辅酶,具有广阔的应用前景.传统PQQ检测方法在检测发酵液中PQQ浓度时都存在一定的缺陷,且检测效率偏低.本研究在大肠杆菌(Escherichia coli BL21 (DE3))中表达E.coli K-12来源的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH),并通过亲和层析分离纯化PQQGDH,得到了高浓度、高纯度的PQQGDH.通过酶液和PQQ样品用量的双因素正交实验对传统重组酶法的反应体系加以改进,得到适用于96孔板高通量检测的反应体系.结果表明30μL纯化后酶液、2μL PQQ样品配合1.2 mL的显色剂组成的显色体系检测效果最佳.该方法线性范围大且具有较高的精确度和重现性.本研究中利用高浓度、高纯度的PQQGDH配合96孔板和酶标仪,所建立的PQQ高通量检测方法,不仅降低了实验误差,而且大幅提高了PQQ发酵液样品的检测效率.%Pyrroloquinoline quinone (PQQ) is a new coenzyme that has broad application prospect.Previous methods used for measuring PQQ in fermentation broth are defective and low-efficient.Inthis study,D-glucose dehydrogenase (PQQGDH) from Escherichia coli K-12 was expressed inE.coli BL21 and then purified by the nickel-affinity chromatography column.For thehigh-throughput measurement of PQQ the optimal reaction system was found by orthogonalexperiment to contain 30 μL PQQGDH,2 μL PQQ sample and 1.2 mL chromogenic reagent.Themethod was linear within a wide range and had high precision and good reproducibility.Comparedwith traditional methods,the high-throughput measurement of PQQ using purified PQQGDH,96-well plate and microplate reader are herein more accurate and efficient.

摘要： 以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldhL分别连接至表达载体pETDuet,获得共表达质粒pETDuet-ldhL-gdh.经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21 (DE3) /pETDuet-ldhL-gdh.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力.在37°C、200r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/LL-苯基乳酸.产物L-苯基乳酸光学纯度(＞99％),底物摩尔转化率(59.55％),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸.

摘要： 低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)是一种能使双歧杆菌增殖的功能性低聚糖,是以蔗糖为原料通过果糖基转移酶的转化而生成的.目前最常用的G级FOS中含有约30％葡萄糖和10％以上的蔗糖,而葡萄糖和蔗糖是糖尿病人和肥胖者不宜食用的.在产品中除去葡萄糖,提高蔗糖的转化率,生产P型FOS(即低聚糖含量≥90％高纯度FOS)是发展低聚果糖产业亟待解决的课题.葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase,EC1.1.1.47,GDH能特异地催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸,是生产高纯度FOS的重要用酶.目前葡萄糖脱氢酶主要从牛的心脏提取,产品主要依靠进口.本文研究葡萄糖脱氢酶的克隆、表达,构建高产酶的工程菌,并研究了重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质.

摘要： 采用交联法将葡萄糖脱氢酶(GDH)和多壁碳纳米管为基础(MCNT)、无金属配位的溴卟啉(ο-BrPETPP)一起固定在玻碳电极表面上，制备了以卟啉为电子介质的葡萄糖酶电极，并用循环伏安法和极化曲线法研究了其电化学性能。结果表明，GDH/poly-ο-BrPETPP/MCNT葡萄糖酶电极对B-D(+)葡萄糖的氧化具有电催化活性，并能保持其生物活性，可应用于酶生物燃料电池的阳极催化剂。在含0.5mM NAD和60mM β-D(+)葡萄糖的0.05M磷酸缓冲溶液中，极化曲线表明葡萄糖在0.5V(vs.SCE)开始氧化，并在放电电压为0.6V时其电流密度达到最大值为62.27 μA/cm2。

摘要： 本文通过PQQ上的羧基与壳聚糖(CHIT)上氨基反应将PQQ-GDH共价键合到CHIT和纳米碳管(CHIT-CNT)膜上，实现了固定化PQQ-GDH与电极间的直接电子传递。

摘要： 4-氯-3-羟基丁酸乙酯(ChBE)是多种药物的手性中间体,可由4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)选择性还原制备,而辅酶高效再生是绝大多数氧化还原酶实际应用的瓶颈。本研究将辅酶NADPh再生关键酶葡萄糖脱氢酶(GDh)和乙醛还原酶(ARI)偶联表达。采用双启动子构建乙醛还原酶基因(alr)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的重组质粒,导入大肠杆菌BL21(DE3),获得重组菌BL21/pET-alr-T7-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,ARI酶活达到2.13U/mg,GDh酶活达到19.06U/mg。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白乙醛还原酶表达量占全菌胞内可溶性蛋白的13%,而葡萄糖脱氢酶表达量占全细胞内可溶性蛋白的39%,实现了乙醛还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的高效共表达。采用该重组菌还原COBE在无辅酶添加的体系中转化22h摩尔转化率达到70.778%,产物R-ChBE的e.e.值为92%以上,较好地实现了一菌双酶偶联制备ChBE。

摘要： 本文介绍采用果糖基转移酶和葡萄糖脱氢酶同时作用于蔗糖的双酶法,由于葡萄糖脱氢酶不会产生H2O2,所以无需昂贵的过氧化氢酶协同作用,可以降低成本,产品纯度可以达到85.97﹪,然后只需一次纳滤分离,即可轻松地获得95.37﹪纯度的低聚果糖,收率达到95.12﹪.

摘要： 本发明的课题在于，以高效率大量生产能够更准确地测定葡萄糖量的新型FAD-GDH。本发明提供一种转化体，导入有编码黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的DNA，所述DNA选自以下的(a)～(f)：(a)编码以序列编号20表示的氨基酸序列的DNA；(b)由以序列编号19表示的碱基序列的DNA；(c)具有与以序列编号19表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA；(d)编码以序列编号34表示的氨基酸序列的DNA；(e)由以序列编号33表示的碱基序列的DNA；(f)具有与以序列编号33表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。另外，本发明还提供使用该转化体的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法。

摘要： 本发明涉及利用包含酶和电子传递物质的反应体系测定葡萄糖浓度的技术。在本发明中，提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖浓度测定方法。在本发明中，还提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖传感器。

摘要： 本发明提供了一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法，具体的本发明通过高密度发酵破壁离心后的上清作为粗酶液，将粗酶液中的乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶经戊二醛交联制备共交联酶聚集体，而且通过添加吐温80将共交联酶聚集体的酶活回收率提高到82％。

摘要： 本发明公开了一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L‑叔亮氨酸的方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。本发明方法包括向反应体系中添加底物三甲基丙酮酸，葡萄糖，调节体系的pH值在8.0‑9.0，加入经过外加烟酸等物质的培养基培养过的共表达菌株破碎的粗酶液(包含亮氨酸脱氢酶，葡萄糖脱氢酶及辅酶)之后开始反应，通过控制反应过程的温度在25‑30°C，pH值在8.0‑9.0，生产L‑叔亮氨酸。本发明通过采用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶体系，利用菌体自身含有的辅酶，进行L‑叔亮氨酸制备，具有单批次反应底物浓度高，反应效率高，不需要辅酶添加等特点。

摘要： 在培养基中培养伯克霍尔德氏菌属并具有产生葡萄糖脱氢酶能力的微生物，并且从培养基和/或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶，能得到新颖的葡萄糖脱氢酶，它是具有高底物特异性的酶，生产成本低，不受测试样本中溶解氧的任何影响，具有特别高的热稳定性。

摘要： 本发明的课题在于，以高效率大量生产能够更准确地测定葡萄糖量的新型FAD-GDH。本发明提供一种转化体，导入有编码黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的DNA，所述DNA选自以下的(a)～(f)：(a)编码以序列编号20表示的氨基酸序列的DNA；(b)由以序列编号19表示的碱基序列的DNA；(c)具有与以序列编号19表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA；(d)编码以序列编号34表示的氨基酸序列的DNA；(e)由以序列编号33表示的碱基序列的DNA；(f)具有与以序列编号33表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。另外，本发明还提供使用该转化体的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法。

摘要： 本发明涉及利用包含酶和电子传递物质的反应体系测定葡萄糖浓度的技术。在本发明中，提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖浓度测定方法。在本发明中，还提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖传感器。

摘要： 本发明涉及利用包含酶和电子传递物质的反应体系测定葡萄糖浓度的技术。在本发明中，提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖浓度测定方法。在本发明中，还提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖传感器。

摘要： 本发明提供了一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法，具体的本发明通过高密度发酵破壁离心后的上清作为粗酶液，将粗酶液中的乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶经戊二醛交联制备共交联酶聚集体，而且通过添加吐温80将共交联酶聚集体的酶活回收率提高到82％。

摘要： 本发明公开了一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L-叔亮氨酸的方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。本发明方法包括向反应体系中添加底物三甲基丙酮酸，葡萄糖，调节体系的pH值在8.0-9.0，加入经过外加烟酸等物质的培养基培养过的共表达菌株破碎的粗酶液(包含亮氨酸脱氢酶，葡萄糖脱氢酶及辅酶)之后开始反应，通过控制反应过程的温度在25-30°C，pH值在8.0-9.0，生产L-叔亮氨酸。本发明通过采用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶体系，利用菌体自身含有的辅酶，进行L-叔亮氨酸制备，具有单批次反应底物浓度高，反应效率高，不需要辅酶添加等特点。