耐热赖氨酸氨肽酶的原核表达及特性表征

摘要

铜绿假单胞菌NJ-814(Pseudomonas aeruginosa NJ-814)所产氨肽酶具有良好的热稳定性。克隆出该氨肽酶编码基因(lap),测序得知该基因长度为1461 bp,编码486个氨基酸。将lap与表达载体pET-42a(+)连接构建重组基因pET-42a-lap,重组基因转化进入原核表达宿主E.coil BL21(DE3)构建重组菌BLAP,BLAP在16℃低温诱导下成功表达出重组氨肽酶。通过镍柱(Ni-NTA)亲和层析对重组酶进行分离纯化,得到电泳纯的重组酶酶液,纯化倍数和回收率分别为4.7和83.5%。考察该重组氨肽酶的酶学特性,发现该酶的最适pH为8.3,在pH 6.5~9.5之间具有较好的稳定性;最适反应温度为80℃,经过70℃热处理1 h仍能保留60%以上的酶活性;底物特异性研究表明该重组酶能够水解Arg-pNA、Leu-pNA和Lys-pNA,对Lys-pNA的水解能力分别是其他2种的6.6倍和2.4倍,通过酶动力学分析证实了该酶对赖氨酸底物具有最强的亲和力,与野生菌所产的酶一致属于一种赖氨酸氨肽酶。