强力霉素诱导型Cas9基因编辑小鼠胚胎干细胞系的构建

摘要

目的 建立强力霉素(doxmycin,Dox)诱导型Cas9基因编辑小鼠胚胎干细胞系,以满足不同条件下基因编辑的实验需求.方法 根据四环素(tetracycline,Tet)-on诱导表达调控系统的原理,分别构建含有调控元件反义Tet转录激活因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator,rtTA)的表达质粒pCDH-CAG-rtTA-IRES-mCherry和含有Tet应答元件(Tet-responsive element,TRE)及Cas9的表达质粒pTight-Cas9-IRES-GFP-Tight-Puro,其中红色荧光蛋白mCherry通过内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)与rtTA表达,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)通过IRES与Cas9相连,分别指示rtTA与Cas9的表达,Puro抗性基因作为药物筛选标记.将上述两种质粒包装为慢病毒,分步转入小鼠胚胎干细胞中,建立Dox诱导Cas9表达的小鼠胚胎干细胞系.结果 首先通过瞬时转染方法在293T细胞中验证其可诱导性,然后结合报告荧光与药物筛选获得同时整合有调控元件rtTA与应答元件TRE及Cas9的小鼠胚胎干细胞系,该细胞系加入Dox后出现有GFP报告荧光表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,rt-qPCR)结果同时表明Cas9可以被成功诱导表达.结论 本研究成功构建了Dox诱导Cas9表达的小鼠胚胎干细胞系,该细胞系在基因编辑方法上更加灵活可控,具有很高的潜在应用价值.