应用生物发光技术定量检测PCR扩增产物

摘要

目的建立一种基于生物发光技术的定量检测PCR产物的方法,并用于HBV定量PCR检测.方法首先利用ATP硫酰化酶(ATP sulfurylase)将焦磷酸(PPi)定量转化成ATP,然后利用虫荧光素酶(luciferase)系统发光检测ATP,从而确定样品中PPi含量.利用2次PCR法扩增HBV DNA目的片段,并进行回收纯化定量,以之作为阳性标准模板制作标准曲线.选择适当的循环次数扩增样品中HBV DNA,利用化学发光法检测扩增产物中PPi的量,进而确定样品中HBV DNA模板的量.结果当起始模板量为(10～5)×105拷贝,循环次数为25,发光值与起始模板浓度呈现良好的相关.检测32份样品血清,其中23例HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中HBV DNA平均含量为1.6×105拷贝/μl,9例HBsAg(+)、HBeAg(-)、HBcAb(+)标本中HBV DNA平均含量为5.6×103拷贝/μl. 结论本方法是一种操作简便、灵敏度高的定量PCR方法.