微量酶联夹心杂交法定量检测hIL-8 mRNA PCR扩增产物

摘要

目的:建立一种灵敏度高、特异性强、定量、精确、操作简便的微孔板酶联夹心杂交技术,定量检测人IL-8 mR-NA.方法:针对人IL-8 mRNA逆转录聚合酶链反应产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针,其中一条为捕获探针,5'端用活性氨基修饰,与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合,"竖直"地包被在微孔板内;另一条检测探针的3'端标记生物素,和辣根过氧化物酶结合.提取人外周血单个核细胞总RNA,进行RT-PCR扩增IL-8 mRNA,双链DNA产物经热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交,加入检测探针与已杂交的产物结合,经亲和素-辣根过氧化物酶系统检测杂交信号.结果:该法灵敏度为检出16个循环的PCR产物、5×103个PBMCs中的IL-8 mRNA、检测PCR终产物的最高稀释倍数为1:256阳性;特异性试验非目的扩增片段酶联杂交检测未检出阳性杂交信号;精密度试验CV为5.2%.结论:该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点,适合IL-8 mRNA PCR扩增产物的定量检测.