胶原三股螺旋重复蛋白1基因真核表达载体的构建及其与microRNA-30b关系初探

摘要

cqvip:目的 构建pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表达载体,初步探讨胶原三股螺旋重复蛋白1基因(CTHRC1)与microRNA(简写为miR)-30b的关系。方法 设计特异性引物,通过PCR扩增合成含有CTHRC1 CDS+3′UTR区的序列,并克隆至pIRES2-EGFP真核表达载体,得到pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表达载体。采用NheⅠ/XhoⅠ双酶切电泳和测序法进行鉴定;通过脂质体转染法转染Huh7及HepG2细胞评价转染效率;将miR-30b mimic、control、pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒和pIRES2-EGFP质粒转染至293T细胞中,分别采用Western Blot和实时荧光定量PCR法检测转染48 h后CTHRC1蛋白的表达水平及miR-30b的表达水平,初步探讨CTHRC1基因与miR-30b的关系。两组间比较采用独立样本t检验。结果 采用NheⅠ/XhoⅠ双酶切pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表达载体,得到5300 bp和1100 bp两条片段,与预期结果一致,测序结果也显示序列与GeneBank公布序列完全一致,表明pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表达载体构建成功。2 μg和4 μg的pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒转染Huh7及HepG2细胞,转染效率分别可达90%、89%和85%、83%。在293T细胞中,miR-30b组CTHRC1表达下降(P<0.05)。而过表达CTHRC1组中miR-30b的表达下降(P<0.05)。结论 成功构建了pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表达载体;在293T细胞中,CTHRC1基因表达与miR-30b的表达水平相反。