重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

摘要

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径.利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌△xylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率.通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体pET30a(+)连接构建表达质粒pET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体pCDFDute-l连接构建表达质粒pCDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到△xylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 kD的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U·mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U·mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U·mg-1.5L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g·(L·h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g·(L·h)-1高24.32％,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础.