鸡Prox1蛋白核定位信号的预测与鉴定

摘要

Prox1(prospero-related homeobox protein 1)作为转录因子,在胚胎发育与癌症发生中具有重要作用.为预测和鉴定鸡(Gallus gallus)Prox1蛋白核定位信号(nuclear localization signal,NLS),首先对鸡Prox1蛋白进行截短表达,通过荧光观察和亚细胞定位分析确定其NLS所在区域.运用在线软件预测鸡Prox1蛋白截短体中假定的NLS(putative NLS,pNLS),构建鸡Prox1蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体并转染细胞,通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位确定NLS;进一步将鉴定的鸡Prox1蛋白NLS进行保守性分析,并检测其对外源蛋白的核输入能力;另外,利用NLS点突变鉴定鸡Prox1蛋白NLS中的关键碱性氨基酸位点.结果表明,鸡Prox1蛋白N端(1～220 aa)具有细胞核定位特征,NLS预测结果显示其N端存在2个pNLS,分别为pNLS1(15KRRR18)和pNLS2(163RAKRAR168).对pNLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位分析发现,pNLS1和pNLS2共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位.另外,鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2基序在其他禽类、人(Homo sapiens)和不同哺乳动物间均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力.此外,碱性氨基酸点突变实验证实,K15、R16、R18和K165、R166、R168分别是NLS1和NLS2的关键碱性氨基酸位点,这些位点共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位.本研究证实鸡Prox1蛋白存在2个高度保守的NLS,两者共同决定细胞核定位,为后续研究鸡Prox1蛋白细胞核定位的分子机制及功能提供参考依据.