鸡痘病毒载体复制非必需片段优化及强启动子的筛选

摘要

以痘苗病毒启动子P7.5调控的β-半乳糖苷酶(LacZ)基因为检测基因,分别插入三个复制非必需片段构成重组质粒,脂质体介导转染鸡痘病毒中国疫苗株282E4感染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)单层,蓝斑筛选纯化病毒;将重组病毒感染次代CEF,收获细胞后制备提取物,检测其中的β-半乳糖苷酶的活性,由此得到一个基因表达效率高的复制非必需片段pFPV7s.根据痘苗病毒天然启动子P7.5的结构,人工合成4条寡核苷酸,形成一个早期和一个晚期启动子,将合成的启动子进行不同组合,最终形成10个较有代表性的启动子组合;以P7.5为对照,在其下游分别插入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ,并进一步插入pFPV7s构建成鸡痘病毒转移载体,以同样的方法检测β-半乳糖苷酶的活性,得到了表达活性约为p7.5的 3.5倍的LLEE启动子组合.